第十一章--生物药物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达1.doc

第十一章 生物药物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达Ecoli经常用来表达小分子目的蛋白，其特点是表达量高，但不同目的产物的表达量会因各种原因而存在显著的差异。相对于其他表达系统来说，Ecoli生长速度快，DNA转化效率高，因此可以在很短的时间获得目的蛋白并对其进行纯化和分析。另一个特点是用 Ecoli进行基因工程研究开发费用较少，这也是Ecoli表达系统被广泛使用的原因之一。但E. coli不能对蛋白质进行糖基化加工修饰，因此，它更适合那些不需要糖基化的小分子目的蛋白，而对于需要糖基化的目的蛋白则不能使用，只能选择其他表达系统。第一节 人白细胞介素基因的克隆与表达一、人白细胞介素-2融合蛋白工程菌的组建利用聚合酶链式反应和寡核苷酸介导的定向诱变技术构建了白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素IL2-PE40、IL2-PE40KDEL、IL2-PE664Glu和IL2-PE664GluKDEL融合基因的原核表达重组质粒，并实现了高效表达，表达产物占菌体总可溶蛋白的2030。此外，由于这一表达质粒在IL-2cDNA与PE基因连接处引入了惟一的SmaI位点，其5端、3端分别含有惟一的EcoR I、Pst I位点，因此可方便地用其他基因替换IL-2或PE基因而获得相应融合蛋白的表达质粒。(一)实验用主要材料(1)质粒 质粒pMSl5l(含全长PE基因)、IL2-pLY4(人IL-2表达质粒)、pLY-5 (原核表达载体)。(2)PCR引物 P1用于在IL-2 cDNA3端引入Sma I位点；P2用于在PE基因5端引入Sma I位点；P3用于在PE基因3端引入KDEL序列；P4、P5用于分别介导PE的 Lys57Glu57和His246Arg247His249Glu246Glu247Glu249的突变。(3)主要生化试剂 (U-14C)NAD、兔抗鼠或羊抗兔IgG、3，3-二氨基联苯胺、鼠抗IL-2单克隆抗体5C9、兔抗PE血清。(二)人IL-2cDNA和PE基因的末端改造为了获得IL2-PE融合基因，对IL-2和PE基因进行了亚克隆和末端改造。用PCR反应，将克隆在pLY4中的IL-2基因3末端的终止密码子去除，并加上一个Sma I位点。将 pMSl51中的PE基因亚克隆在pUCl8中，然后用PCR反应在5末端加上一个Sma I位点。(三)IL2-PE-pLY5重组质粒的构建用EcoR I和SmaI从pLY4-IL2中切出改造后的IL-2基因，用Sma I和Pst I从 pUCl8-PE中切出改造后的PE40基因；然后将这两个基因组装入用EcoR I和Pst I切开的 pLY5中，就构成含有IL2-PE40融合基因的重组表达载体IL2-PE40-pLY5(图11-1)。IL2- PE664Gul-pLY5重组质粒的构建以及IL2-PE40KDEL-pLY5与IL2-PE664GluKDEL-pLY5重组质粒的构建同此原理。(四)IL2-PE融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达将上述各种分别含IL2-PE40、IL2-PE40KDEL、IL2-PE664Glu、IL2-PE664GluKDEL融合基因的表达载体转化大肠杆菌。转化的细菌在30培养过夜，次日以1：20稀释到LB培养基中，30摇床扩增至A6000406，迅速转至42进行热诱导，继续培养2h后收集细菌。图11-1 重组表达载体IL2-PE40-pLY5的构建留取少量菌体悬于适量1X样品缓冲液中，以用作蛋白质电泳时的对照；其余的菌体则悬浮于120体积的PBS，在冰浴中超声波破碎菌体，10000rmin离心10min，收集沉淀和上清，进行SDS-PAGE分析。所得重组转化子产生的融合蛋白占细菌总可溶蛋白的20 30，说明它们的表达效率都是很高的。这些融合蛋白在细菌内主要以包涵体的形式存在。用鼠抗IL-2单克隆抗体5C9或兔抗PE血清作为第一抗体，对上述IL2-PE融合蛋白进行免疫印迹分析(分别以1L-2、PE为阳性对照)，结果表明，相应分子量的位置有特异性条带出现。二、人白细胞介素-11的克隆及其融合蛋白表达人胎肺原代培养细胞经PMA诱导后，用RT-PCR技术扩增，获得去掉了N端信号肽序列的IL-11cDNA；经序列分析表明，该序列与文献报道序列高度同源，氨基酸序列完全一致。将IL-11cDNA插入到硫氧还蛋白基因融合表达载体pTRXFUS的trxA基因3末端，利用其3端的蛋白肠激酶切点，构建符合读码框的融合基因。G1724菌株含有单拷贝的紧密整合在细菌染色体ampC位点中的cI基因。该基因处在细菌染色体中一个负责合成色氨酸的启动子(trp)的控制下。当培养基中缺乏trp时，c I蛋白的合成阻止了PL启动子的启动；而当培养基中加入trp后，c I不再合成，PL启动子启动融合蛋白trxA-hlL11的大量合成。该融合蛋白在大肠杆菌G1724菌株中表达量达20以上，在大肠杆菌胞质中以可溶性形式存在，并可正确折叠，表现出全部生物学活性。用IL-6依赖细胞株7TD1及MTT法测定生物学活性，达256105UmL菌液。(一)实验用材料(1)质粒 pBluescript KS(简称pKS)、pTRXFUS。(2)受体菌 Ecoli菌株DH5和G1724。(3)培养基 DMEM、1640。(4)工具酶 AMV反转录酶、T4 DNA连接酶、限制酶。(5)试剂 rRNasin、dNTPs、Taq plus 、PMA、RNA-gents、Total RNA isolation systom、IL-11羊抗人多克隆抗体。(6)组织细胞 人胎肺新鲜组织、IL-6细胞依赖株7TD1。(二)人胎肺原代成纤维细胞制备及总RNA的提取制备原代人胎肺成纤维细胞的步骤：新鲜人胎肺组织生理盐水洗净、剪碎加入 0.2胰蛋白酶37消化2h1200rmin离心1min，弃上清沉淀加入生理盐水洗2次用含血清和双抗的DMEM洗1次吹打使细胞分散分装入细胞培养瓶中置37 5CO2培养箱中培养2天一换液再培养(原代细胞)将培养基换成无血清DMEM加入 30L PMA诱导置37、5CO2中培养4h弃去培养液用无菌PBS洗2次胰酶消化收集细胞(约10个瓶)按RNA-gents Total RNA isolation systom说明书提取总 RNA溶于100L。水中加入2L LrRNasin(40UL)。(三)PCR引物的设计(1)5端引物Pl的合成 合成的5端引物P1为：5-CG GGTAC CCC GGG CCA CCA CCT GG-3。该引物去掉了全长cDNA中N端的信号肽序列，引入Kpn I酶切位点(黑体部分)，以便于cDNA克隆；为便于融合蛋白的切割，将IL-11cDNA第一个氨基酸残基脯氨酸CCT换成CCC，从而引入Sma I位点(下划线部分)，以便于插入表达载体中。(2)3端引物P2的合成 合成的3端引物P2为：5-CG GGA TCC GAA GGA CTG TCT CTA ACT AG-3。首先考虑利用终止密码子TGA附近的序列，但这部分序列与cD- NA内部序列高度同源，故选择了TGA后3端非编码区内的一段序列，并加入了酶切位点 BamHI(下划线部分)。(四)RT-PCR合成IL-11cDNA及其克隆(1)RT-PCR 在引物P2引导下，以总RNA为模板，反转录合成IL-11cDNA第一链；再以此为模板，以P1和P2为引物，用Taq plus进行PCR，反应体系50L，反应条件为：94热变性5min；9440s，6240s，721min，35个循环；72延伸10min。反应结束后，在1琼脂糖凝胶上电泳检测。(2)克隆与序列分析 PCR产物为-700 bp左右的片段，与预期结果相符，将此片段克隆人质粒载体DKS中。转化DH5，得到阳性克隆pKShIL-11。对此插入片段进行序列分析，结果表明，人胎肺来源的IL-11 cDNA与文献报道序列高度同源，其中仅111位、183位GA，210位AG，而氨基酸序列没有变化。(五)硫氧还蛋白IL-11融合蛋白表达载体的构建pKSh IL-11用Sma I和BamH I酶切后，插入表达载体pTRXFUS的Kpn I(已消平)及BamH I之间。转化大肠杆菌G1724，得到含重组表达载体pIL-11a的阳性克隆(图 11-2)。pIL-11a序列分析表明IL-11cDNA以正确的读码框架插入到trxA基因的下游，两个蛋白之间有正确的肠激酶切割位点。因此，用肠激酶切去融合蛋白中的硫氧还蛋白，可得到成熟hIL-11。(六)硫氧还蛋白IL-11融合蛋白的诱导表达将含有重组表达载体pIL-11a的大肠杆菌重组菌株接种于IMC(加Amp)培养基中， 30振荡培养过夜，按1接种量转接IMC(Amp)培养基，于30培养不同时间(17h)后，分别加人色氨酸(终浓度100gmL)诱导，再转入37培养4h，收集菌体。图11-2 重组表达载体pIL-11a的构建在10 SDS-PAGE上检测硫氧还蛋白IL-11融合蛋白的表达情况。结果表明，30培养 23h后，表达效果最好。而30培养25h，诱导表达不同时间发现，诱导4h的表达效果最佳，表达量经扫描达20，分子质量约35kD。(七)hIL-11融合蛋白的活性测定用IL-6