【基金】2010CB126000-棉花纤维品质功能基因组研究及优质高产新品种的分子改良

项目名称：棉花纤维品质功能基因组研究及优质高产新品种的分子改良首席科学家：喻树迅 中国农业科学院棉花研究所起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：农业部一、研究内容根据上述国家重大需求所必需解决的关键科学问题，本项目拟从以下几个主要方面开展系统研究：1、棉花品质产量基因资源创制及遗传因子的精细定位（1）在已获得的特异纤维材料的基础上，继续创造高产、棉纤维发育突变体，初步构建高产、棉花纤维突变体库，创造棉纤维发育特异材料；（2）构建高密度的分子标记图谱，发掘与品质、产量等性状紧密连锁的分子标记和功能标记，定位本项目获得的功能基因；（3）完善陆地棉背景的海岛棉导入系，利用导入系将控制棉花纤维品质、产量性状的QTL定位到相应染色体片段上，实现QTL的精细定位；研究QTL与QTL之间的互作以及QTL与非QTL之间的互作，探讨提高棉花产量和纤维品质的机制。（4）研究棉花纤维品质和产量遗传构成的多样性和等位基因效应。2、利用转录组学研究棉纤维品质形成的基因表达分子机制： （1）利用已建成的包括29,000个棉花cDNA的微阵列芯片，获得在棉纤维分化和突起、伸长、加厚等过程中特异性表达的棉花cDNA，揭示其可能调控或参与的代谢途径，阐明胚珠表皮纤维突起及伸长的决定因素。（2）分离鉴定植物激素信号途径对棉纤维发育起重要调控作用的基因，通过时空表达特性，推测这些基因在棉纤维发育过程中的作用。（3）分离和鉴定棉花纤维素合成相关基因，探索纤维素合成的网络调控关系，阐明棉纤维数量和长度的调控机制。3、棉纤维发育的蛋白质网络及重要功能蛋白质的鉴定（1）制作不同发育时期和不同品质特性的棉纤维细胞蛋白质谱，鉴定在棉纤维发育过程中差异显示的蛋白质，构建纤维发育的功能蛋白质网络；（2）找出在棉纤维发育过程中重要的差异表达蛋白质，重点研究调控纤维细胞分化和细胞壁合成的重要蛋白，并结合这些蛋白质在发育过程中的丰度变化及修饰特征，分析这些蛋白质在棉纤维发育过程中的相互作用和分子功能；（3）克隆这些重要功能蛋白质的基因，构建不同表达特征的棉纤维特异表达的载体，转化棉花来验证这些重要蛋白质的生物学功能，解析其影响棉纤维形态建成的分子机制，并为改良棉纤维品质的基因过程提供基因元件。4、棉纤维发育的重要转录因子的分离与功能分析：（1）分离新的棉纤维发育的重要转录因子以及受其调控的重要功能基因；（2）进一步研究棉花MYB、HOX等类转录因子的功能和调控机制，为棉纤维品质改良的基因工程提供靶基因；（3）构建不同的转基因载体，将转录因子基因转入棉花以及模式植物，进行功能验证和棉纤维品质改良。5、目的基因在棉花中的高效功能验证及评价（1）鉴定棉纤维发育中特异高效表达的启动子及其调控原件与作用机理；（2）对项目组筛选出的有价值的目标基因在棉花中进行功能验证，并创制转目标基因棉花种质新材料；（3）对转外源基因的棉花纤维材料进行深入系统评价，并研究其在棉花不同发育阶段基因表达规律。6、优质高产棉花品种的分子改良（1）利用项目获得的转基因新材料和新标记，开展从性状表型到QTL直至基因序列等多层次的遗传变异信息的系统整合分析，研究品质和产量性状间的遗传关系；（2）建立生物信息学数据库及网络分析系统，为其他课题提供相应的分析方法和工具；（3）建立棉花优质、高产品种分子设计的技术体系，揭示棉花纤维品质和产量同步提高的分子机制；（4）创制纤维品质和产量显著改良的新材料和新品系。二、预期目标项目总体目标： 应用遗传学、功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学等理论和方法，开展棉花纤维发育的生物学机制的研究，发掘棉花纤维品质和产量相关功能基因，进一步揭示棉花纤维品质和产量性状的遗传基础和纤维发育的分子机制，筛选和创制一批有利用价值的特异纤维材料，提出棉花品质和产量性状分子改良的新理论和方法，为优质高产棉花新品种培育提供材料基础和科学依据。五年预期目标: 1利用上期“973” 初步鉴定的优质材料，创制并筛选出遗传稳定的优质高产特异新材料50份以上，同时创制突变材料500份以上；发掘品质、产量性状紧密连锁的分子标记50-70个，建立包含200个左右的单片段导入系；精细定位20个左右的棉花纤维品质产量性状的QTL，明确这些QTL之间及它们与染色体背景的互作关系。2建立具有国际水平的大规模功能基因筛选与分离克隆的新体系，分离并克隆纤维细胞突起、伸长、加厚等阶段特异性表达基因30-50个；研究这些基因的表达谱，阐明8-10个伸长阶段特异性表达棉花基因的生物学功能；研究棉花胚珠表皮纤维数量和质量的关键因素；初步明确棉花纤维不同发育时期的分子机制及调控规律。3构建棉纤维发育过程中差异显示的蛋白质网络，鉴定4-5个调控纤维细胞壁合成的重要功能蛋白，分离与克隆这些重要功能蛋白质的编码基因3-5个，并进行生物学功能验证。4分离10-15个棉纤维发育的转录因子基因以及受其调控的重要功能基因，鉴定3-5个转录因子基因功能；进一步研究棉花HOX与MYB2和RDL1等转录因子在棉纤维发育过程中的调控机制，找到转录因子参与棉纤维发育调控的直接证据；揭示转录因子调控棉纤维分化发育的分子机制，为棉纤维品质和产量的改良提供目的基因。5筛选棉纤维发育中高效表达的启动子8-10个；在棉花中验证候选基因50-70个，创制不同类型棉花种质新材料70-100份；建立棉花纤维细胞瞬时表达体系；对转基因材料进行基因表达规律的深化研究。6明确品质和产量性状间的互作关系，主效QTL、纤维品质相关基因的聚合遗传效应；建立生物信息学数据库及遗传网络分析系统；优化棉花品质、产量同步提高的分子改良技术体系；揭示棉花纤维品质和产量同步提高的分子机制；创制在产量、品质等目标性状上表现突出的育种材料30-50份；培育纤维品质与产量同步显著改良的棉花新品系3-5个。7申请专利20-30项；发表具有重大或重要影响的学术论文20-30篇，其中IF10的论文3篇以上；获得国家级奖励1-2项；造就一批具有国际影响力的在棉花分子生物学及遗传改良方面的中青年科学家，培养研究生100名以上。三、研究方案1. 学术思路： 采用多学科相互交叉和渗透的途径，深入研究棉花纤维发育的生物学机制、品质形成机理和优质高产品种改良的分子基础。研究棉花纤维品质形成的基因表达机制和蛋白表达代谢机制，分离与克隆重要功能基因，并利用高效转化和基因评价体系对候选基因进行快速功能验证和评价。研究纤维数量与品质间的调控模式、品质与产量间的互作关系及其遗传调控网络，探明棉花纤维品质及产量同步改良的分子机制，建立棉花品种分子设计的理论和方法体系，创制在品质、产量等目标性状上表现突出的育种材料。探明品质与产量同步改良的理论基础建立棉花纤维品质分子改良的技术平台创制纤维品质和产量同步改良新种质揭示纤维品质及产量形成的遗传基础功能基因重要蛋白的功能分析功能验证和评价功能蛋白纤维发育生物学机制遗传学研究转录因子研究蛋白组学研究基因组学研究特 异 棉 纤 维 材 料创制新材料2. 技术途径： 3. 创新点与特色：（1）研究方案创新：全面系统研究棉花纤维品质、产量性状形成的复杂性和特殊性，阐明纤维品质性状的形成机理及其与产量间的互作关系和遗传调控网络。本项目突破以往的工作将纤维品质和产量独立研究的局限，采用遗传学、生理学、功能基因组学、蛋白质组学等多学科相互交叉和渗透的途径，通过基因工程突破遗传限制，把育种学面临的问题和分子生物学方法、技术有机结合在一起，深入系统地开展优质、高产棉花新品种培育基础理论、分子机制和改良技术，为进一步开展优质高产棉花新品种培育提供理论、方法依据，为推动我国优质棉花产业和棉纺织业的可持续发展做出贡献。（2）研究方法创新：在研究纤维发育的生物学机制的基础上，将功能基因组学与蛋白质组学研究相结合，鉴定与品质、产量性状密切相关的关键基因及重要代谢途径；通过研究棉花纤维各个发育阶段特异性基因表达，探索不同发育时期的分子调控机制；通过棉花高效规模化转基因技术验证平台鉴定各个基因的功能；利用生物信息学研究品质与产量间的基因网络及遗传效应，建立棉花品种分子设计的理论和方法体系。（3）研究成果创新：本项目能获得一批新的、具有自主知识产权的与棉花品质和产量相关的特异表达启动子、关键功能基因和主效QTL，建立棉花基因组和蛋白质组数据库；筛选和创制一批特异纤维材料，建立一套棉花品种分子设计的理论和方法体系，为棉花分子育种提供理论基础。（4）研究对象独特：棉纤维细胞是由胚珠外珠被表皮细胞分化发育而成的单细胞，是研究植物细胞伸长、纤维素合成和细胞壁发育等生理过程的理想材料。同时，纤维细胞的生长发育过程也是纤维品质和产量的形成过程，与纤维品质和产量有密切的关系。因此研究棉花纤维细胞的生长发育具有重要的理论意义和实践价值。（5）基础材料丰富：项目组拥有我国唯一的国家棉花中期库和唯一的国家野生棉活体种质圃，已储备和积累了项目进行纤维研究所必需的各种特异类型的基础材料，能够确保研究目标的顺利完成。（6）队伍结构合理：品种遗传改良优势单位与基础研究优势单位紧密协作、强强联合，研究队伍年龄结构、知识结构及学科结构合理，优势互补，能够保证项目的实施和完成，解决纤维品质和产量同步改良中的重大科学问题。4. 可行性分析： 本项目采用全新的思路、方法和独特的创新材料，对棉花品质和产量这两个存在负相关的复杂性状同时在基因发掘、定位克隆、基因的表达与调控等方面进行遗传学、功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学等多学科综合研究，并进行二者的互作关系及遗传调控网络研究，完全可能在棉花优质和高产品种改良的分子基础等重大科学问题的研究上取得预期的重大突破。（1）项目组已储备了丰富多样的棉花品质和产量相关的遗传材料，为本项目奠定了坚实的材料基础。本项目主要依托单位中国农业科学院棉花研究所分别在河南安阳、海南三亚建成了国家棉花种质资源中期库和国家种质野生棉圃，收集了大量与棉花品质和产量相关的遗传材料以及纤维发育突变体材料，为开展本项目研究提供了坚实的材料基础。（2）日趋完善的功能基因组学和蛋白质组学研究等技术，为本项目的顺利实施提供了重要技术保障。大规模测序技术的发展使得快速获得特定阶段的表达谱已成为可能，拟南芥、水稻、杨树等基因组计划取得的研究成果，为研究棉花纤维品质、产量等复杂性状提供了理论及技术指导；固相二维电泳技术的发展以及多维色谱技术的优化，使得从某一特定组织的蛋白样品，寻找出1000-2000种功能蛋白质成为可能，为全面揭示棉花纤维品质和产量性状的遗传基础和分子机制提供了重要技术参考。（3）模式植物实验系统的完善，为本项目通过比较基因组研究方法研究棉纤维的功能基因提供了方法。已有研究表明拟南芥叶表皮毛与棉纤维是同类细胞，因此，可以研究拟南芥和烟草细胞中同源基因的功能，从中筛选出潜在的与纤维发育有关的重要功能基因，同时，通过棉花基因在拟南芥或烟草细胞中的过量表达，分析鉴定棉纤维特异表达相关的顺式元件，了解棉纤维基因表达的调控机制。（4）年富力强、学科整齐的研究团队，为本项目顺利实施提供了人力资源保障。本项目联合了中国农业科学院棉花研究所、北京大学、清华大学、中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所、华中农业大学、西南大学、浙江大学和河北农业大学等国内主要从事棉花遗传学、功能基因组学、蛋白组学、生物信息学及分子遗传改良的优势科研单位或大学，研究实力雄厚，技术力量强大。项目参加人员多为中青年专家，学科背景齐全，知识结构合理，优势互补，有丰富的工作积累、研究经验和较强的创新能力，充分满足了本项目应用多学科综合优势对棉花纤维功能基因组学与分子改良进行全面深入研究的需要。（5）前期研究基础及技术积累，为本项目完成奠定了良好的技术基础。国家重点基础研究发展计划（973）:在国家“973”计划支持下，2004年立项支持开展了“棉花纤维品质功能基因组学研究及分子改良”研究，明确了乙烯和超长链脂肪酸在棉花纤维伸长期的调控作用，初步构建了235个差异蛋白在棉花纤维发育不同时期的表达谱，克隆了40余个纤维品质的相关基因，并在棉花上进行了功能验证，初步建立了棉纤维品质分子改良的技术体系，并选育出40余份优质材料，获得国家科技进步二等奖2项，为优质棉花新品种的分子改良奠定了一定的理论、方法和材料基础。国家重点基础研究发展计划（973）: 2003年立项开展了“重要农作物品质性状功能基因组学研究与分子改良的研究”，其中课题三“大豆和棉花品质性状相关基因的分离、表达及功能研究”在克隆棉纤维发育相关基因及其功能解析方面取得了创新的成果，首次比较深入地研究了棉花转录因子基因GaMYB2、GaHOX1等，发现基因具有调控植物表皮毛发育的功能，对棉纤维的起始与发育可能起重要的调控作用，达到了国际先进水平。分离了RDL1和GaMYB2的启动子,具有棉纤维/表皮毛特异表达的活性；分离了棉花3个homeobox基因（HOX1, 2, 3），发现这三个棉花HOX因子以不同方式参与表皮细胞的分化发育调控。这些研究结果对揭示棉纤维发育调控和纤维细胞伸长机制有重要意义，为棉纤维改良基因工程提供了候选基因和调控元件。国家高技术研究发展计划(863计划)：2006-2010年项目“棉花纤维品质相关功能基因的克隆与验证”，获得在纤维快速伸长期特异性表达并有完整阅读框的全长cDNA 157个，获得数十个与棉花纤维发育相关基因，并初步验证其基因的功能。获得与纤维品质性状相关的83个QTL，其中在多环境表现稳定的纤维品质性状相关的主效QTL共4个，获各综合性状理想的纤维优良材料50份，纤维长度在33mm以上、比强度在44cN/tex以上。2006-2010年项目“优质高产棉花分子品种创制”，初步建立了分子标记辅助育种技术体系，挖掘出与产量性状相关的50个QTL；与棉花早熟性相关的33个QTL，与棉花黄萎病抗性有关的9个QTL，与纤维品质性状相关的25个QTL。（6）项目所依托的设备齐全的国家重点实验室(中心)，是国内从事棉花分子生物学研究主要基地，为项目顺利实施提供了条件保障。项目依托国家棉花改良中心、国家棉花种质资源中期库(河南安阳)和国家种质野生棉圃(海南三亚)、华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室和国家农作物分子技术育种中心、北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室、植物分子遗传国家重点实验室、河南省棉花生物学重点实验室、清华大学蛋白质科学教育部重点实验室、河北省作物种质资源重点实验室等仪器设施条件齐备，功能完善，具有完成本项目研究的技术平台。综上所述，本项目具有先进的研究思路、创新的研究材料、可靠的技术路线、完备的仪器设施，加上学科齐全和富有创新能力的研究团队以及高效的管理运作机制，可保证项目的顺利实施和完成。四、年度计划研究内容预期目标第一年1）创造棉纤维发育特异和突变材料，渐渗和聚合近缘棉种优异纤维品质基因，构建高密度的分子标记图谱；2）分离克隆棉花纤维突起阶段特异性表达基因，分离并分析伸长阶段功能蛋白和及其磷酸化修饰等；3）分离克隆棉纤维特异表达基因的启动子，对项目组筛选出的有价值的目标基因（简称目的基因，下同）在棉花中进行功能验证，并评价转外源基因棉花纤维材料；4) 收集、整理已有资料，进行生化快速检测体系的研究。1）获得渐渗材料1000份，单片段导入系200个，突变体初始材料3000份，棉花种质系5-10个，转基因棉花新种质材料10-15份；2）构建包含超过2000个SSR标记的棉花高密度遗传连锁图；3）获得棉纤维突起阶段特异性表达cDNA200个，启动子2-3个，棉纤维表达的转录因子基因10个以上；4）完成短纤维分化过程的所有差异表达蛋白质的质谱鉴定；5）验证候选功能基因15-20个，筛选1个对棉花纤维品质性状具有重要贡献的新基因；6）发表研究论文3-6篇，申报专利1项。第二年1）继续棉纤维发育特异和突变材料、优异纤维基因的渐渗和聚合，更高密度分子标记图谱的构建等工作；2）研究上述基因的表达情况，阐明部分基因功能，研究纤维素代谢相关基因的功能；3）继续分离与鉴定棉纤维发育重要功能蛋白质，构建棉纤维细胞伸长与分化的蛋白质网络图构建等；4）继续鉴定棉纤维发育中特异的启动子并研究其作用机理，继续目的基因功能验证，转外源基因棉花纤维材料评价；5） 继续筛选纤维品质相生化标记，建立生化快速检测体系。1）获得海岛棉、达尔文棉、黄褐棉和毛棉回交5代材料，筛选出突变体2000份。得到棉花种质系5-10个，转基因棉花新种质材料30-40份；棉花新品系1-2个；2）构建包含2500个SSR标记的棉花高密度遗传连锁图；3）鉴定纤维发育基因50个以上，阐明3-5基因的功能，棉纤维细胞高效表达的启动子累计3-5个，棉纤维表达的转录因子基因10个以上；4）完成差异表达蛋白质的质谱鉴定和磷酸化蛋白质分析犯法方法的建立以及相关论文的撰写投稿等工作；5）验证的候选功能基因累计25-30个，筛选2-3个对棉花纤维品质性状具有重要贡献的新基因；6）发表研究论文4-7篇，申报专利1项，培养研究生20-30名。第三年1）继续棉纤维发育特异材料创制、突变体筛选等工作，通过生化标记和分子标记辅助选择进行多性状聚合育种等工作；2）进行基因的功能鉴定，棉纤维细胞伸长与分化的蛋白质网络图的构建，纤维伸长阶段功能蛋白的编码基因分克隆、抗体制备、分子标记等；3）继续鉴定棉纤维发育中特异的启动子并研究其作用机理，对目标基因在棉花中进行功能验证并评价转外源基因棉花纤维材料；4）数据总结分析，论文撰写。1）筛选突变体1000份，获得棉花种质系5-10个，转基因棉花新种质材料累计50-60份，棉花新品系1-2个；2）完成差异表达蛋白质的质谱鉴定和磷酸化位点的鉴定，蛋白质网络图的构建，网站建设，撰论文撰写投稿等工作；3）阐明植物激素对纤维发育的关键作用，提出利用植物激素信号途径中关键调节基因改良棉花纤维品质的新策略；5）累计鉴定启动子5-7个，克隆4-5重要蛋白的编码基因及其抗体的制备，深入研究3-4个转录因子的功能；6）累计验证候选功能基因35-40个，筛选3-4个对棉花纤维品质性状具有重要贡献的新基因；7）初步获得稳定遗传的生化标记，并用于标记辅助选择育种；8）发表学术论文8-15篇，培养研究生20-25名，申报专利3项。第四年1）继续棉纤维特异材料田间试验评价等工作，通过生化标记和分子标记辅助选择进行多性状聚合育种，并继续研究棉花纤维发育基因的调控网络机理；2）继续载体构建、模式植物和棉花转化等工作，进行纤维伸长阶段功能蛋白的编码基因的分离、表达研究；3）继续鉴定棉纤维发育中特异的启动子并研究其作用机理；继续目标基因的功能验证，评价转外