LC-MSMS法测定人血浆中卡络磺钠的浓度.doc

LC-MS/MS法测定人血浆中卡络磺钠的浓度赵华，宋敏，杭太俊(中国药科大学药学院药物分析教研室，南京 210009)摘要 目的：建立人血浆中卡络磺钠浓度的LC-MS/MS测定法，并用于卡络磺钠的人体药代动力学研究。方法：24名健康志愿者单剂量口服90mg卡络磺钠胶囊，于服药前及后0.17，0.33，0.5，0.67，1.0，1.25，1.5，2.0，3.0，4.0, 5.0，6.0和8.0h分别采集血样，APCI正离子化LC-MS/MS法测定血浆中卡络磺钠的浓度。结果：卡络磺钠LC-MS/MS测定法在0.5 ngmL-150 ngmL-1范围呈现良好线性，方法回收率为92.0%101.0%。批内、批间精密度RSD分别为1.18%1.52%和5.51%9.84%。主要血浆药动学参数Cmax为(20.92 8.35) ngmL-1，Tmax为(1.16 0.51) h，t1/2为(2.51 0.95) h，MRT为(4.11 1.09) h，AUC0-8为(65.87 25.31) hngmL-1，AUC0-为(75.53 28.63) hngmL-1，Vz/F为(5071.68 2713.88) L，CL/F为(1311.10 386.55) Lh-1。结论：健康志愿者单剂量口服90mg卡络磺钠胶囊后，卡络磺钠血浆浓度-时间曲线符合二房室模型。Cmax在9.77 ngmL-138.88 ngmL-1范围，Tmax在0.5 h3 h范围，个体差异较大。关键词：卡络磺钠；药代动力学；LC-MS/MS Determination of carbazochrome sodium sulfonate in human plasma by LC-MS/MSZHAO Hua*作者简介: 赵华，女，药物分析硕士研究生 Tel: (025)83271090 E-mail: , Song Min, HANG Tai-jun(Department of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, NanJing, 210009，China)Abstract Objective: To establish an LC-MS/MS method for the determination of carbazochrome sodium sulfonate in human plasma and study its pharmacokinetics. Methods: A single oral dose of 90 mg carbazochrome sodium sulfonate capsules was given to each of 24 Chinese healthy volunteers. Blood samples were collected before and 0.17，0.33，0.5，0.67，1.0，1.25，1.5，2.0，3.0，4.0, 5.0，6.0, 8.0 h after the administration. The drug plasma concentrations were determined by a validated LC-MS/MS method in APCI positive ion mode. Results: The calibration curve of the LC-MS/MS method was linear in the range of 0.5 ngmL-1-50 ngmL-1 with the accuracy from 90% to 105%. The intra-day and inter-day precession (RSD) were 1.18%-1.52% and 5.51%-9.84%, respectively. The main pharmacokinetic parameters of carbazochrome sodium sulfonate after a single oral dose 90mg were as follows, Cmax (20.92 8.35) ngmL-1，Tmax (1.16 0.51) h，t1/2 (2.51 0.95) h，MRT (4.11 1.09) h，AUC0-8 (65.87 25.31) hngmL-1，AUC0- (75.53 28.63) hngmL-1，Vz/F (5071.68 2713.88) L，CL/F (1311.10 386.55) Lh-1. Conclusion: The plasma concentration-time profile of carbazochrome sodium sulfonate fits two compartment models after oral dose of 90 mg capsules. The ranges of Cmax and Tmax were 9.77 ngmL-1 - 38.88 ngmL-1 and 0.5h -3h that means there was great individual difference in the absorption and distribution process of carbazochrome sodium sulfonate.KEY WORDS: carbazochrome sodium sulfonate; pharmacokinetics; LC-MS/MS卡络磺钠(Carbazochrome Sodium Sulfonate)是新一代止血剂，为卡巴克洛(安络血)的衍生物(图1)，它在分子结构上引入磺酸钠基团，克服了卡巴克洛溶解度小、必须由水杨酸助溶的缺点，使这一化合物产生了明显的止血效果。临床主要用于泌尿系统、上消化道、呼吸道和妇产科疾病出血，亦可用于外伤和手术出血1等的治疗。目前还未见国内外有关卡络磺钠血浆药物浓度测定及其药动学研究的报道。国外文献报道主要集中于卡络磺钠药理学研究2及新剂型的研究上3。体液中卡络磺钠浓度测定的难点在于浓度低、内源性物质的干扰大。本文分别考察了卡络磺钠在不同色谱柱以及在不同pH条件下的色谱保留行为；优化了卡络磺钠血浆样品的处理条件；采用大气压化学离子化(APCI)方式 选择性反应离子监测(SRM)模式检测卡络磺钠特征碎片离子，最大程度上避免了内源性物质干扰，建立了卡络磺钠血浆浓度的专属灵敏度的LC-MS/MS测定方法，并对24名健康志愿者口服90mg卡络磺钠胶囊后的药动学进行了研究。图1卡络磺钠(A) 与盐酸阿米洛利(B,内标) 的化学结构式Fig1 Chemical structures of carbazochrome sodium sulfonate (A) and amiloride hydrochloride (B, internal standard)1 仪器、试药Finnigan TSQ Quantum Ultra三重四级杆串联质谱仪, Xcalibur 1.2工作站, Thermo Surveyor 液相色谱仪(美国热电公司)。卡络磺钠胶囊(南通久和药业有限公司，10mg每粒)；卡络磺钠对照品(南通久和药业有限公司；纯度99.3%)，内标盐酸阿米洛利(购自中国生物制品鉴定所；纯度99.5%)；甲醇(色谱纯，美国TEDIA产品)，超纯水(自制)。2 试验条件2.1 色谱条件LiChrospher ODS-2(150 mm4.6 mm，5 mm) 色谱柱；甲醇(A)-0.2%甲酸水溶液(B)流动相，采用梯度洗脱：0 min(10%A)2 min(10%A)4 min(60%A)6 min(60%A) 6.1 min(10%A)7 min(10%A)；流速1.0 mL.min-1；进样量20 mL。2.2 质谱条件 正离子大气压化学离子化(APCI)，选择性反应离子监测(SRM)，检测卡络磺钠的离子反应为m/z 148.030 eV m/z 107.0；检测盐酸阿米洛利(内标)的离子反应为m/z 230.020eV m/z 171.0。放电电流10 A，毛细管温度350，鞘气压力2.41105 Pa，离子吹扫气压力6.90 103 Pa；辅助气压力6.90 104 Pa。2.3 统计方法 测得的志愿者血浆中卡络磺钠浓度-时间数据使用DAS 2.0统计软件处理。3 试验方法3.1 志愿者及给药方案 24名年轻健康男性志愿者，经体检证实心、肝、肾功能正常，试验前2周及试验期间未用其他任何药物，试验前经伦理委员会审批和签署知情同意书。服药前志愿者禁食过夜(10小时以上)，于次日早晨8:00空腹服用试验用卡络磺钠胶囊(10 mg/粒)9粒，用200 mL温开水送服。每例志愿者均于服药前5 min在前臂静脉安置留置针,抽取空白血样5 ml。并分别于服药后0.17，0.33，0.5，0.67，1.0，1.25，1.5，2.0，3.0，4.0, 5.0，6.0和8.0h各采血5 mL，血样标本收集于干燥、洁净并经过肝素抗凝处理的玻璃管内，离心分离血浆，血浆样本置- 20 冰箱保存待测。服药后1 h可饮水，4 h进统一清淡饮食。3.2 溶液的配制 卡络磺钠标准溶液：取卡络磺钠对照品约5 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，以甲醇-水(50:50)为溶剂溶解并定容至刻度，摇匀，得储备液，并定量稀释配制成5,10, 25, 50, 100, 200, 250和500 ngmL-1的系列标准溶液。盐酸阿米洛利(内标)溶液：取盐酸阿米洛利对照品约5 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，以甲醇-水(50:50)为溶剂溶解定容至刻度，摇匀，并定量稀释配制成50 ngmL-1溶液，作为内标溶液。3.3 血浆样品处理 精密吸取血浆样品0.5 mL，置1.5 mL聚塑离心管中，精密加入内标溶液液50 mL，加入14高氯酸100 mL，沉淀蛋白，涡旋2 min，12500 g离心10 min，分取上清液作为供试液，取20 mL进行LC-MS/MS分析。4 方法学评价4.1 专属性 测得卡络磺钠和盐酸阿米洛利APCI正离子全扫描质谱及其母离子的CID二级质谱分别如图2和图3所示，质谱裂解过程如图4。上述色谱条件下测得空白血浆、空白血浆添加卡络磺钠和内标、及志愿者服药1.0 h后血浆样品的典型色谱如图5所示。由图可见卡络磺钠的保留时间约为6.14 min，内标的保留时间约为6.03 min。内源性物质对测定无干扰，能准确测定血浆中卡络磺钠的浓度，本方法具有较高的专属性。图2 卡络磺钠(A) 和阿米洛利(B) 全扫描质谱图Fig. 2 Positive APCI full scan mass spectra of carbazochrome sodium sulfonate (A) and amiloride (B)图3 卡络磺钠(A) 和阿米洛利(B)的二级质谱扫描图Fig. 3 Positive APCI product ion mass spectra of carbazochrome sodium sulfonate (A) and amiloride (B)图4 卡络磺钠(A)与阿米洛利(B)的质谱裂解过程Fig. 4 Proposed APCI-MS fragmentation processes for carbazochrome sodium sulfonate and amiloride图5 卡络磺钠血浆样品浓度LC-MS/MS测定典型图A.空白血浆； B.空白血浆添加卡络磺钠(tR=6.14 min, C=2.5 ng.mL-1)，内标(tR=6.01 min, C=5.0 ng.mL-1)；C.志愿者服药1.5 h后血浆样品卡络磺钠(tR=6.14 min, C=33.5 ng.mL-1，内标(tR=6.03 min, C=5.0 ng.mL-1).Fig. 5 Representative chromatograms(A) blank plasma; (B) plasma spiked with 2.5 ngmL-1 of carbazochrome sodium sulfonate (tR=6.14 min) and 5.0 ngmL-1of amiloride hydrochloride (tR=6.01 min); (C) sample plasma collected 1.5 hours after oral administration of carbazochrome sodium sulfonate capsule (90 mg) carbazochrome sodium sulfonate (tR=6.14 min, C 33.5ngmL-1; internal standard tR=6.03 min, C 5.0 ngmL-1)4.2 线性范围和定量下限 精密吸取各浓度“卡络磺钠标准溶液”50 mL，分别置1.5 mL聚塑离心管中，精密加入空白血浆0.5 mL，配制成卡络磺钠浓度为0.5, 1, 2.5, 5, 10, 20, 25和50 ngmL-1的血浆样本。按上述“血浆样品处理方法”，自“精密加入内标溶液50 mL”起同样操作，并进行色谱分析，记录卡络磺钠色谱峰面积(As)与内标色谱峰面积(Ar)。以峰面积比R(R= As/Ar)对浓度(C, ngmL-1)进行线性回归分析，回归方程为：R =0.05033C+0.005430， r=0.9999 (0.50-50.0 ngmL-1)。卡络磺钠最低定量限(LLOQ)为0.5 ngmL-1，灵敏度良好。4.3 回收率与基质效应试验 配制浓度分别为1.0 , 10和20 ngmL-1的血浆样本各5份。按“3.4”项下自“精密加入内标溶液50 L”起操作，测定卡络磺钠与内标的色谱峰面积(As)。取甲醇-0.2%甲酸水(60:40)代替血浆，配制浓度分别为1.0 , 10和20 ngmL-1的溶液，各精密加入内标溶液50 L和加入适量甲醇-0.2%甲酸水(60:40)配制为对照品溶液，测定卡络磺钠与内标的色谱峰面积(Ar)。取空白血浆0.5mL加14高氯酸0.1mL沉淀蛋白后分取上清液，再分别加入配制浓度为1.0 , 10或20 ngmL-1血浆样品0.5mL相同量的标准溶液和内标溶液，测定卡络磺钠与内标的色谱峰面积(Am)。按As/Am100计算，即得绝对回收率；Am/Ar100计算，即得基质效应。将各浓度样本与内标的面积比R代入血浆随行标准曲线，计算测定浓度，并与加入浓度比较，即得卡络磺钠的相对回收率。结果见表1。方法回收率良好，基质效应不明显89.4104.4，表明本方法准确度良好。表1 血浆中卡络磺钠回收率和基质效应试验结果 Tab.1 Summary of assay recovery and matrix effect of carbazochrome sodium sulfonate in human plasma4.4 批内、批间精密度试验 多批次(n=3)配制浓度分别为1.0 , 10和20 ng.mL-1的血浆样本各5份，并分别进行测定。测定结果(表2)，批内和批间测定精密度良好(RSD%分别1.181.52%，5.5113.6%)。表2 血浆中卡络磺钠精密度试验结果Tab 2 The intra- and inter- day precision and accuracy for carbazochrome sodium sulfonate 4.5 稳定性考察 对照品溶液在5冰箱中放置12 h及24 h、含药血浆在室温下放置12 h、含药血浆反复冻融3次及含药血浆-20冰箱长期放置5 d、15 d、30 d等条件下稳定性均良好，10 ngmL-1浓度测定值的RSD均小于15。5 药动学参数计算结果24名健康志愿者单剂量口服90 mg卡络磺钠胶囊，测得平均血药浓度-时间曲线见图6。主要药动学参数见表3。表3 24名志愿者口服9粒卡洛磺钠胶囊(10mg/粒)后的卡络磺钠主要药代动力学参数Tab 3 Pharmacokinetic parameters of carbazochrome sodium sulfonate after a single oral administration of 90 mg carbazochrome sodium sulfonate capsules in 24 Chinese healthy male volunteers图6 24名健康志愿者单剂量口服90mg卡络磺钠胶囊后血浆卡络磺钠平均浓度-时间曲线Fig. 6 Mean plasma concentration-time profile of carbazochrome sodium sulfonate in 24 healthy volunteers after single oral dose of 90 mg carbazochrome sodium sulfonate capsules6 讨论卡络磺钠含有弱碱性的缩氨脲基团和与强碱成盐的磺酸根基团，在水中显两性，液相色谱保留行为多样。分别比较了酸性和碱性条件下卡络磺钠在SAX柱，C18柱，PFP柱和C8柱上的保留行为。结果卡络磺钠在酸性条件下C18柱上保留较强4，并且质谱检测时离子化效率较高。为了获得良好的反相色谱保留强度、与内源性成分较好分离、抑制基质效应，选择甲醇-0.2%甲酸水流动相系统进行梯度洗脱。卡络磺钠极性大、水溶性强，考虑采用蛋白沉淀法处理血浆样品。比较了甲醇、乙腈、14高氯酸及7高氯酸等沉淀剂对卡络磺钠回收率的影响。结果，14高氯酸的绝对回收率在90左右，而且在酸性条件下，血浆样品内源性物质干扰的影响可有效得到控制，血浆处理过程简单，沉淀剂用量少，不影响测定灵敏度。试验考察了卡络磺钠的电喷雾离子化(ESI)和大气压化学离子化(APCI)方式，以及正、负离子检测模式。结果显示，采用ESI正离子检测，样品内源性物质干扰较大，无法准确测定；采用ESI负离子检测，内源性物质干扰小，但样品测定灵敏度低，无法满足低浓度点测定要求；采用APCI负离子检测，无特征离子；采用APCI正离子检测特征碎片离子，内源性物质不干扰测定，灵敏度高。优化并确定了正离子APCI选择性离子反应检测(SRM)参数，获得了专属性强、分析时间短、灵敏度高的卡络磺钠血浆样品测定条件，最低定量限为0.5 ngmL-1。卡络磺钠为缩氨基脲类衍生物，母环为吲哚环。根据质谱检测条件、测得质谱并参考文献5推断相应的离子反应裂解途径如下：在APCI源中，样品受高温作用，磺酸根与吲哚环相连价键断裂，离子化产生m/z 219的离子，其缩氨基脲上的质子可进一步发生源内重排裂解后主要产生m/z 148离子。经CID作用m/z 148离子特征性地裂解丢失中性分子乙腈并可扩环生成稳定的m/z 107氮杂桌环离子。本试验采用选择性反应检测(SRM)测定特征离子反应m/z 148.0 30 eV m/z 107.0，专属性强，检测灵敏度高，内源性物质不干扰，实现了血浆中卡络磺钠浓度的高灵敏准确测定。而选用m/z 219离子对卡络磺钠进行SRM (m/z 21918 eV m/z 146) 测定时，内源性空白干扰严重，无法准确测定（图7）。健康志愿者单剂量口服90mg卡络磺钠胶囊后，卡络磺钠血浆浓度-时间曲线符合二房室模型。Cmax在38.889.77 ngmL-1范围，Tmax在0.53h范围，个体差异较大。图7 选择m/z 219离子测定卡络磺钠时空白血浆(A)及标曲中浓度点(10 ng.mL-1 )(B)色谱图Fig.7 chromatograms of carbazochrome sodium sulfonate with select of m/z 219 ion(A) blank plasma; (B) plasma spiked with 10 ngmL-1 of carbazochrome sodium sulfonate (tR=4.60 min)图1卡络磺钠(A) 与盐酸阿米洛利(B,内标) 的化学结构式Fig1 Chemical structures of carbazochrome sodium sulfonate (A) and amiloride hydrochloride (B, internal standard)AB图2 卡络磺钠(A) 和阿米洛利(B) 全扫描质谱图Fig. 2 Positive APCI parent ion mass spectra of carbazochrome sodium sulfonate (A) and amiloride (B)AB图3 卡络磺钠(A) 和阿米洛利(B)的二级质谱扫描图Fig. 3 Positive APCI product ion mass spectra of carbazochrome sodium sulfonate (A) and amiloride (B)图4 卡络磺钠(A)与阿米洛利(B)的质谱裂解过程Fig. 4 Proposed APCI-MS fragmentation processes for carbazochrome sodium sulfonate and amilorideABC图5 卡络磺钠血浆样品浓度LC-MS/MS测定典型图A.空白血浆； B.空白血浆添加卡络磺钠(tR=6.14 min, C=2.5 ng.mL-1)，内标(tR=6.01 min, C=5.0 ng.mL-1)；C.志愿者服药1.5 h后血浆样品(卡络磺钠tR=6.14 min, C=33.5 ng.mL-1，内标tR=6.03 min, C=5.0 ng.mL-1)Fig.5 Representative chromatograms(A) blank plasma; (B) plasma spiked with 2.5 ngmL-1 of carbazochrome sodium sulfonate (tR=6.14 min) and 5.0 ngmL-1of amiloride hydrochloride (tR=6.01 min); (C) sample plasma collected 1.5 hours after oral administration of carbazochrome sodium sulfonate capsule (90 mg) carbazochrome sodium sulfonate (tR=6.14 min, C 33.5ngmL-1; internal standard tR=6.03 min, C 5.0 ngmL-1)图6 24名健康志愿者单剂量口服90mg卡络磺钠胶囊后血浆卡络磺钠平均浓度-时间曲线Fig. 6 Mean plasma concentration-time profile of carbazochrome sodium sulfonate in 24 healthy volunteers after single oral dose of 90 mg carbazochrome sodium sulfonate capsulesAB图7 选择m/z 219离子测定卡络磺钠时空白血浆(A)及标曲中浓度点(10 ng.mL-1 )(B)色谱图Fig.7 chromatograms of carbazochrome sodium sulfonate with select of m/z 219 ion(A) blank plasma; (B) plasma spiked with 10 ngmL-1 of carbazochrome sodium sulfonate (tR=4.60 min)表1 血浆中卡络磺钠回收率和基质效应试验结果 Tab 1 Summary of assay recovery and matrix effect of carbazochrome sodium sulfonate in human plasmaadded concentrationRelative recoveryAbsolute recoverymatrix effectng.mL-1XSD/%RSD%XSD/%RSD%XSD/%1.0101.04.84.989.42.21099.25.05.1101.40.782090.63.2表2 血浆中卡络磺钠精密度试验结果Tab 2 The intra- and inter- day precision and accuracy for carbazochrome sodium sulfonate theoretical concentration ng.ml-11.001020batch one1.099.0120.950.989.0119.730.939.2119.271.049.3318.701.039.1220.57batch two1.0810.0820.770.989.7120.541.019.2620.441.0210.6720.851.0510.6720.30batch three1.179.8919.041.1410.7119.081.0810.4321.321.0310.1619.611.1010.0019.16Mean1.059.8220.02DIF%4.79-1.820.11inter-day RSD%9.8413.65.51intra-day RSD%1.521.261.18表3 24名志愿者口服9粒卡洛磺钠胶囊(10mg/粒)后的卡络磺钠主要药代动力学参数Tab 3 Pharmacokinetic parameters of carbazochrome sodium s