第二章+基因工程的酶学基础.ppt

第二章基因工程的酶学基础 磷酸二酯键 核酸酶 生物体内存在一类对DNA和RNA作用的酶 DNA酶 RNA酶 限制性内切酶 能使DNA分子在内部特定的位点上断裂的酶 核酸外切酶 从DNA分子末端移去核苷酸的酶 反转录酶 以mRNA为模板合成出互补DNA的酶 DNA连接酶 能使DNA分子连起来的酶 基因工程的工具酶 教材P12 1 掌握一些重要的酶的概念 特点 反应特征和应用 2 掌握一些重要的酶的作用机制及应用 3 掌握DNA的片断化 连接和重组的一些方法 技术及应用 本章要点 本章的主讲内容 6学时 3次课 第一节限制性核酸内切酶 第二节DNA连接酶 第三节DNA修饰酶 第四节基因工程其它工具酶 第一节限制性核酸内切酶 要点介绍 1 了解并掌握一些基本概念的掌握如限制性核酸内切酶 同尾酶 同裂酶 识别序列 切割位点 位点偏爱等 2 了解酶的命名方法 3 掌握限制性核酸内切酶的种类及区别 识别序列及特征 作用机制 反应体系和影响因素等 4 了解内切酶的性质 功能和应用 5 掌握DNA分子片断化的方法 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 主要为细菌 少数霉菌和蓝藻 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 R M体系 R M体系组成 寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶R M体系的作用 保护自身的DNA不受限制 破坏外源DNA使之迅速降解 第一节限制性核酸内切酶 来源识别序列切割位点作用机制基因工程中的应用 教材P13 表2 1 www rebase数据库 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 教材P39 第一节限制性核酸内切酶 教材P39 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 P46 在PH不合适 或甘油浓度过高 10 时 限制性内切酶的切割位点会出现非专一性 因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 四 酶切反应 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第一节限制性核酸内切酶 第二节DNA连接酶 要点 连接酶的种类特征和区别反应机制影响反应的因素 科学家发现细胞中线状的DNA分子经常能够自动环化起来 形成稳定的环状结构 而在体外 线状的DNA分子虽然也能够自动环化起来 如果没有任何其它酶的作用 这种结构将是很不稳定的 容易在加热后重新解开成线状 1967年 世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化两条DNA的末端之间形成磷酸二酯键的酶 即DNA连接酶 第二节DNA连接酶 第二节DNA连接酶 E coliDNA连接酶DNA连接酶是由大肠杆菌染色体编码的 T4DNA连接酶 是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的 连接酶的来源 P21 3 热稳定DNA连接酶 三 两种酶的区别 表2 4 1 两种酶来源不同 2 两种酶的作用机理不同 能源辅助因子不同 3 DNA体外连接方式不同 1 用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断 4 作用对象不同 2 用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来 或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly dA poly dT 尾巴之后 再用DNA连接酶将它们连接起来 第二节DNA连接酶 酶 AMP复合物生成 第二节DNA连接酶 DNA连接酶 NAD T4DNA连接酶 ATP 教材P22 第二节DNA连接酶 第二节DNA连接酶 体系 反应程序 第二节DNA连接酶 第三节DNA修饰酶 理解DNA修饰酶的作用掌握DNA修饰酶的种类 特征 区分掌握DNA修饰酶的用途 在DNA的切割与连接过程中 经适当的限制性核酸内切酶处理或机械法处理产生的DNA片段 其末端是各种各样的 相同的粘性末端容易连接 而其它类型的末端连接都比较困难 在适当的情况下必须对这些末端进行各种 修饰打扮 才有可能被连接酶顺利地连接起来 生物体内存在着各种类型的修饰酶 能为DNA或RNA分子的末端进行各种 修饰打扮 如末端脱氧核糖核苷酸转移酶 T4多核苷酸激酶和碱性磷酸酶等等 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 1 碱性磷酸酶 来自于大肠杆菌或小牛肠道 可以去掉DNA分子的5 端的磷酸基团 2 T4多核苷酸激酶 来自于T4侵染的大肠杆菌 它能催化 磷酸从ATP分子上转移给DNA或者RNA的5 OH末端 在5 端增加磷酸基团3 末端脱氧核苷酸转移酶 来自于小牛胸腺组织 在DNA分子的3 端增加一个或多个脱氧核苷酸 第三节DNA修饰酶 末端转移酶 是从小牛胸腺中提取的 该酶能催化5 脱氧核糖核苷酸进行5 3 方向的聚合作用 逐个地将脱氧核糖核苷酸分子加到线性DNA分子的3 OH末端 给DNA的3 OH末端加上一个多脱氧核糖核苷酸的同聚物尾巴 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 T4多核苷酸激酶在DNA分子克隆中的主要用途是 标记分子的5 末端 使缺失5 P末端的DNA补上磷酸 发生磷酸化 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 第三节DNA修饰酶 第四节其它工具酶 了解一些其它酶的作用和用途 核酸外切酶基因操作过程中经常要针对性地降解掉DNA双链中DNA RNA杂种双链分子中的一条链 以满足某些特殊的实验要求 达到特殊的实验目的 这时会经常用到一些核酸外切酶