高效液相色谱仪-串联质谱法鉴别十字花科植物中硫代葡萄糖苷.doc

南京科捷分析仪器有限公司高效液相色谱仪/ 摘要：建立超高效液相色谱仪串联质谱法鉴别十字花科植物中硫代葡萄糖苷的分析方法。采用70甲醇水溶液提取白芥种子中的硫代葡萄糖苷，通过反相C12柱分离，电喷雾一离子阱一飞行时间质谱测定。利用硫代葡萄糖苷二级质谱裂解产生的mz l95，241，259，275，291特征离子和伴随产生的80，162，163，196，242 Da中性分子丢失规律，共鉴别出5种硫代葡萄糖苷。硫代葡萄糖苷(简称硫苷)是广泛存在于十字花科植物中的含硫次级代谢产物，主要分布于植物的根、茎和叶中。当植物细胞受到破坏(如挤压、虫咬等)后，硫苷与植物内生的黑芥子酶接触，降解产生异硫氰酸酯、恶唑烷酮和硫氰酸酯等化合物J，其中异硫氰酸酯具有良好的生物活性，而且对人畜无害。因此硫苷及其降解产物的研究引起了科学工作者的浓厚兴趣。根据侧链R基团的不同，目前已发现约l20种硫苷，其中有多种具有抗癌、抗肿瘤、杀菌和杀虫活性的异硫氰酸酯，如吴华等比较几种异硫氰酸酯的杀线虫活性，发现烯丙基和丙烯酰基异硫氰酸酯具有良好的杀线虫活性。大量研究表明甲硫基己基异硫氰酸酯等具有良好的抗肿瘤活性，是非常具有潜力的抗癌药物。硫苷的检测方法主要是传统的化学方法和现代的仪器分析手段。化学方法耗时、误差大、操作繁琐，只能测定硫苷总量。液相色谱法具有很高的分离效率，但对于硫苷单体鉴别需要对照品，无法满足快速鉴别硫苷的需要。笔者采用超高效液相色谱一离子阱-飞行时间质谱联用技术，既能高效分离硫苷，又能准确、快速鉴别硫苷。对于硫苷及降解产物的研究具有重要意义，同时又能够提高工作效率。1实验部分1.1主要仪器与试剂超高效液相色谱仪-离子阱-飞行时间质谱仪： LCMSIT-TOF型，日本岛津公司；数显恒温水浴锅：HH-6型，真空干燥箱：VD23型，德国81NDER公司；电子天平：AUY220型，日本岛津公司；超声波清洗器：KS-120E1型旋转蒸发仪：R-216型，瑞士BUCHl公司；台式高速离心机：H-1650型，研磨机：All基本型，德国IKA公司；白芥种子：产地为湖北武汉；正己烷、氯仿、乙酸铵、甲酸：分析纯甲醇：色谱纯，美国Fisher公司；实验用水为美国Pall公司Purelab Ultra超纯水系统制备的超纯水，电阻率为18.2 MQcm。1.2硫代葡萄糖苷提取白芥种子在105干燥3h，以灭活黑芥子酶保护硫苷。干燥种子经粉碎后，过420m筛。称取粗粉约50g于锥形瓶中，依次用正己烷50mL，氯仿50mL各3次除脂。残渣经真空干燥，用300mL沸腾的70甲醇水溶液浸泡，超声提取30min，连续2次，合并提取液，静置至室温。提取液经离心分离，将清液真空下浓缩至原体积的20。取lmL浓缩液经石墨化碳脱色，滤液供超高效液相色谱-串联质谱分析。1.3流动相配制用电子天平准确称量乙酸铵0.385g，置于1L量瓶中，加入lmL甲酸，用水溶解定容后，经0.22m微膜过滤，超声波脱气后使用。l.4液质联用分析条件(1)UPLC条件ODS Cl8柱(100mmx 2.1mm，3.5m，日本岛津公司)；柱温：30；流动相A：5mmolL乙酸铵1甲酸溶液；流动相B：甲醇；流动相流速：0.2 mLmin；进样体积：20L；梯度洗脱：03 min,98%A；325min，9820A；2530min，2020A；3035min，20-98A。(2)MS条件ESl负离子模式；电压：-3.5kV；雾化气： N2，流量为1.5 Lmin；干燥气压力：100kPa；碰撞气：Ar；检测器电压：1.7 kV；Heat Block温度：200；CDL温度：200；一级质谱扫描范围：mz300700；母离子扫描范围：mz 315650；二级质谱扫描范围：mz 50700；离子累积时间：l0ms； CID碰撞能量：100；碰撞气能量：l00。2结果与讨论2.1分析条件选择硫苷在水溶液中是亲水性阴离子化合物，在反相色谱柱中，保留时间短。优化实验发现，在ODS c18柱上采用流动相A(5mmolL的乙酸铵+0.1甲酸)和流动相B(甲醇)能够很好分离，并且有很好的质谱响应。质谱Heat Block和CDL温度采用200，温度过高会造成硫苷裂解，过低则影响离子化和脱溶剂化效果。为获得比较丰富的二级离子碎片信息，CID碰撞能量和碰撞气能量均采用100。2.2分析结果按照l.4分析条件检测白芥种子提取液，获取硫苷提取离子流色谱图及其一、二级质谱图(见图1图ll)。根据裂解机理，并参考文献9一l2，共鉴定出5种硫苷，结果见表1。2.3质谱碎片离子裂解机理二级质谱特征离子，对于鉴别硫苷具有重要意义。在MS2中，母离子先后失去S0。(80 Da)和 C6H10O5(162Da)后产生242Da中性分子丢失，氢重排后出现相对应的R-C(SH)一NO-离子。另一裂解途径是硫苷上的氢发生重排后，失去 C6H1105(163Da)和C6H1205S(196Da)中性碎片。与此同时，二级质谱中还能观察到mz l95，241，259，275，291的特征离子，这些离子是由于硫与相邻碳原子发生断裂，并伴有氢重排形成的。硫代葡萄糖苷负离子模式下主要特征二级碎片离子裂解机理见图123结语利用高效液相色谱仪一串联质谱技术快速、高效、准确的分离与鉴定十字花科植物中硫代葡萄糖苷，对硫代葡萄糖苷二级质谱80，162，163，196，242 Da中性分子丢失和mz l95，241，259，