WB问题分析.doc

WesternBlot问题解答1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。2.条带歪斜、或漂移:因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。3.单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。4、转膜缓冲液过热：缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高,转膜过程中注意降温。在冰水混合物中转膜，效果很好。5背景过高:1）封闭不全， 5%脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。5)曝光时间的控制:通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。6、没有信号：1)用单抗时比较容易出现这种情况。因为单抗主要是针对天然蛋白，这个时候.TWEEN-20的作用就显现出来了，它可以增加抗原抗体复合物与膜的结合。2)确信你的蛋白表达。3)确信蛋白高效的转移到你的膜上4)一抗二抗的效价问题。无论哪个无效都不能发光，因此预实验一定要从最低的稀释度开始，以排除抗体的因素。5)ECL试剂盒质量的问题，不可小觑。偶亲身经历。碰到一批次品。两个月白搭！7、微量进样器堵了怎么办？首先从预防入手，每次用后的进样器及时用蒸馏水清洗！如果堵了，不要紧，有办法：可以用如下办法解决：1）首先反复推拉上样针，看是否可将堵塞物吹出来；2）方法1不灵，若是25或50ul的针，把针从后侧拔出，然后重新插入，使其内部产生气压，可能压出堵塞物质；3）如上述方法不灵可以在拔出后注入些清水，然后重新插入，用水压排出，4）最后的方法，最灵的方法：开始步骤同第3种方法中，在加入水后，将上样器的前端针部放在酒精灯上煅烧至红色（估计在什么位置堵的），注意烧红部分不要距离玻璃过近，然后，趁热突然推针，将水强行推出，通道打开后，再通过稀酸或稀碱冲洗即可！5）或者放在超声清洗仪里，超声试试注意，切记在推拉过程中小心不要把针弄弯8、关于SDS蛋白电泳的一点心得最近在做蛋白电泳时候遇到了些麻烦，在这里发了帖子，并且得到了很多同人的恢复。本人在看过回帖后，结合自己的试验，重新设计了方案，得到了满意的结果，同时感觉有必要拿来和大家分享：1）蛋白电泳中出现的纵向条带：原因主要是由于电泳样品或是电极缓冲液中有没有溶解的样品颗粒所致，上样前充分将样品离心，或重新使用新配电极缓冲液即可解决。2）电泳条带前沿在染色脱色后呈尖形。原因是由于上样量大且工作电压过大引起，我实验中采用90/120，后来改用了80并且不换电压；同时减少上样量到原来的一半，得到了满意的结果（我的样品分子量18000Da，15%的分离胶）；3）电泳结束后，染色脱色结果整个胶面呈现蓝色，背景很重怎么也脱不去，改用新配的电极缓冲液。问题解决。是电极缓冲液污染的结果（平时本人有个坏毛病：喜欢在缓冲液中涮上样针，导致缓冲液污染）。9.分别用多大电流转膜?1）一般跟你的分离胶的浓度有关。2）与你的转印系统型号有关。3）与目的蛋白的分子量有关一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h；10.好几个蛋白，我做免疫荧光都做得很好，抗体说明也是可以用于western的，可是就做不出来！显影后只有很弱的非特异带。而另一个蛋白，perk却做得很好，操作都是一样的，抗体稀释也是按厂家说明的。1)你用的是单克隆抗体吗？如果是的话，请注意western是在蛋白质变性的条件下进行的，活性状态下可以反映的抗体在变形状态下却不一定特异性很强，可能其他的蛋白质变性之后产生了能与之反映的抗原决定簇！另外，要做好对照！抗体是什么公司的？有的公司会将抗体稀释后再卖（奸商），所以抗体的滴度，根据公司的要求也不一定准！2)如果是单抗，westernblotting电泳后蛋白变性，构象表位可能消失，仅存在线性表位，单抗可能不识别。所以WESTERNBLOTTING做不出来了。11.我的WESTERN为什么出现了多条带，每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律，为什么？是封闭时间不够吗？请指教我做WESTERN是想知道处理后细胞分泌细胞因子数量的变化，这样必须要内参吗？可能性1)一抗、或二抗抗体浓度太高2)多克隆抗体本身的非特异性反应3)抗体的特异性不强4)蛋白异构体或降解！5)你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化。所以严格意义上说，内参事必须做的。12.转膜的时候，最下端的蛋白条带很清楚，可是上边啥都没有看见，社么原因？1)可能是时间不够，因为一般是分子量小的先转上去的，大的后转，看你的目的蛋白了，如小的话，最后不要太长时间2)转膜的时间要根据你的目标蛋白大小和胶浓度而定。蛋白越大、胶浓度越高，时间就要越长。经验是：1218的胶、418kD的蛋白用100v衡压/350mA衡流7590min的条件都可以成功转膜3)主要是转膜时间不够，若想证明这个问题，可把原来的SDS-PAGE，做一下染色，看看大分子量的蛋白是否仍在胶上。另外，做western时，转膜并不是最复杂的，但无疑是很重要的，如果胶上残存的目的蛋白过多，会使与抗体结合的蛋白负荷不足，而影响实验结果，因而要反复摸索转膜时的时间、电压/电泳，直到获得满意转膜效果。WB的关键点我觉得有一下几个：一是样品的处理；二是电泳和转膜条件的摸索；三是保证试剂、抗体的质量。13.westernblot怎样做内参照阿？1）可以转膜后先用目的蛋白的抗体做杂交，将抗体洗掉，再用内参蛋白的抗体重新杂交，结果显示信号亮度一致，认为上样量一致；。2）同样条件做两块胶，等量上样，同时转膜；一块做内参蛋白，一块做目的蛋白。3）只做一块胶，用蛋白marker做标记，转膜后用丽春红染色，可见到42kd（-actin）左右处有浓染的条带，在42kd略上方将膜剪开分别作杂交即可。要求目的蛋白和内参蛋白大小有一定的差异。转大分子量的蛋白可以在转膜液中加入SDS至0.05%，并且可以适当减少甲醇用量，如15%的甲醇电泳中SDS是十二烷基硫酸钠。十二烷基磺酸钠简称为SAS，两者的区别是其中S的化合价不同，各是多少没去考证。由于最初翻译者将SDS翻译为十二烷基磺酸钠，被很多书籍引用，故十二烷基磺酸钠为误称。真正的十二烷基磺酸钠不能用于WESTERN。14.胶为什么总是漏？1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件，下次用之前，用75酒精擦拭玻璃和胶条，能有效防漏，且利于剥胶。2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干就OK了（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，赢伟凡士林不导电，会影响第2相的效果的7）你可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。8）因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，所以封条封不严，重新对齐后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，一般不会再漏。9）先把两块玻片放在夹子上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样一般就不会漏胶了。但是如果你放了垫片再对齐玻片底部，或者在桌子上对其玻片底部然后放到架子上的话，经常会漏胶15.条带跑得比正常的窄？1）可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀2）是不是有窄有宽？可能与你拔梳子的时候有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。3）可能是你样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢，好像与你的预想不一致4）常见的原因是：每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致5）可能是系统的ph出了问题，有可能是你的电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液看看，看是否能成功16.为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢？1）微笑是因为你灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。“倒微笑“也称“皱眉“现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象2）书上说出现“微笑”是因为整个胶冷凝的不均匀，中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加APS和TEMED后应该混合均匀。3）样品中盐浓度过高？点样量太多或每孔点样量不均匀？电泳电压不稳定或过高？17.Western-blot制胶时好多泡泡怎么办？1）首先，玻璃板一定要洗干净，用洗洁净洗，冲干净后再用双蒸水冲一，晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。2）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。3）倒胶的时候，用1ml的枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡！4）将胶在小烧杯里配好后，将电泳槽略微倾斜，将烧杯的嘴靠在玻璃边缘，直接倒进去，速度快，而且不容易产生气泡，不妨试试5）用双蒸水封时建议用200ul的枪加水，这样压力小，以免把胶冲起来！6）国产的只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。7）分离胶中的气泡与插梳子有关，垂直插容易产生气泡，且不容意排除。将梳子倾斜5-10度插入，即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。8)还有一个制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。18.一些琐碎的细节，但却是实验中可能经常遇到的令人头痛的问题：1）安装好的制胶装置，最好先用配置电泳缓冲液的水加满检验一下是否漏水，检验确认不漏水的装置再用于制备凝胶。确认不漏水后，倒出水，然后使其尽量流出，其实残留的一点水并不影响结果，而且还会使电泳好的凝胶容易剥落下来。漏水的装置制作的凝胶尽管可以使用，但它会造成电泳时候电流的分流，不但影响电流的效率，而且还会使部分加样孔的条带歪曲。2）制胶时最好最后加入AP，这样可以避免偶然情况下不能马上灌胶而导致胶的聚合，确认所有的东西准备齐全了，再最后加入AP，混合均匀后马上灌胶。一定要使配胶的几种溶液混合均匀，这是制得性质均一的凝胶的前提。3）进口的AP可以很快使胶凝聚。所以，AP的用量最好比书上推荐的用量少点，这样可以使胶的溶液慢慢聚合，这更有利于形成均匀一致的凝胶。也不会使操作变得手忙脚乱。4）有时候，梳子拉出以后，明明看不到加样孔中有凝胶，但是就是加不进去样品，这主要是由于梳子与较大的那块玻璃之间的缝隙中存留的制胶溶液凝聚后形成的很薄的一层凝胶造成的。由于很薄，当梳子拉出后，它就会和玻璃分离，刚好将加样孔的口封住了，如果用20ul的加样器加样的话，这层凝胶很容易将样品堵在外面，只要将这层凝胶除去，就可以顺利加样了。如果用专门的微量进样器，不会存在这样的问题。5）薄膜原因可能是由于梳子和slide的厚度不是十分一致，而这可能是无法避免的。除此之外，也有由于拔出梳子时候造成的堵塞现象，个人认为，这样的堵塞现象可以通过插入梳子时先用水（配置电泳缓冲液的水）湿润梳子的方法避免，这样还有利于形成整齐的加样孔。不管怎么做，一定要等胶完全聚合好了再拉出梳子。如果孔的形状变化了，扭曲了，肯定会导致条带不一致，结果不好。（6）加样的时候也是用专门的微量进样器，是宁波出的，50ul容量，每次都是用20ul的上样量。以前等胶干后拔出梳