土壤微生物学特征的测定.doc

土壤微生物学特征的测定一 土壤微生物量碳、氮的测定将新鲜的土壤样品含水量调节至田间含水量的30%50%，25下密封预培养710d,以保持土壤均匀和不同的地方所得结果的可比性。然后迅速测定土壤微生物量碳氮，或在低温4下保存。采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法测定土壤微生物量碳氮，即称取预处理的湿润土壤每份20.0g（烘干基重）放入50ml烧杯中，将其置于底部有少量NaOH、少量水（约200ml）和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3-5min；然后，将干燥器移置在黑暗条件下25熏蒸土壤24h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。将熏蒸好的土壤转移到200ml提取瓶中，加入约80ml 0.5mol/LK2SO4提取液（土水比为14），振荡30min后过滤，得土壤提取液每份土样重复3次。同时做未熏蒸空白和试剂空白。 土壤微生物量碳：用重铬酸钾氧化法测定 吸取10ml土壤提取液于150ml消化管中，加入0.2mol/LKCrO和浓硫酸各5.0ml，再加入少量沸石，混匀，于175磷酸浴中煮沸10min。冷却后全部移入150ml三角瓶中，使总体积约80ml，加入2滴邻啡罗啉指示剂，用0.05mol/LfeSO滴定至砖红色。 土壤微生物量碳（Bc）=Ec/Kc，Ec表示未熏蒸与熏蒸对照土壤的浸取有机碳的差值，Kc未转换系数，取值0.38。土壤微生物量氮：用凯氏定氮法测定取20ml土壤提取液于250ml消化管中，加入0.19mol/LcuSO溶液0.4ml、浓硫酸6.7ml消化至澄清，冷却后进行定氮。土壤微生物量氮（Bn）=En/Kn，En为熏蒸与未熏蒸对照土壤矿质态氮的差值，Kn为转换系数，取值0.45。二 土壤酶活性的测定 土壤过氧化氢酶活性用高锰酸钾滴定法、脲酶活性用靛酚蓝比色法测定。过氧化氢酶活性以20min后每克土消耗。0.02mol/L高锰酸钾毫升数表示，脲酶活性一24h后每百克土NH3-N的毫克数表示。每各土样重复三次测定。三 土壤基本理化性状测定一、土壤pH值的测定土壤样品用水浸提或用中性盐溶液浸提（如酸性土壤可用1molL氯化钾溶液；中性和碱性土壤可用00lmolL氯化钙溶液浸提）。水土比一般为2.5：1；盐碱土水土比5：1；泥炭为10：1。经充分搅拌，平衡30min，用酸度计或pH计测定试剂配制：1 、pH4.01标准缓冲溶液：将10.21g苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4，分析纯，105烘干）溶于1000m1蒸馏水中。2、pH687标准缓冲溶液：将339g磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯，45烘干）和3.53g无水磷酸氢二钠（Na2HP4，分析纯，45烘干）溶于1000m1蒸馏水中。3、pH9.18标准缓冲溶液：称取3.80g硼砂（Na2B4O710H2O溶于1000ml煮沸冷却的蒸馏水中。装瓶密封保存。4、1mol/L氯化钾溶液：将74.6g氯化钾（KCl，分析纯）溶于1000m1蒸馏水中。该溶液的pH值为5.5-6.05、0.01mol/L氯化钙溶液：将147.02g氯化钙（CaCl22H2O，分析纯）溶于1000ml蒸馏水中，即1molL氯化钙溶液。取10ml 1molL氯化钙溶液于500ml烧杯中，加入500ml蒸馏水，滴加氢氧化钙或盐酸溶液调节pH6，然后用蒸馏水定容至1000ml，即0.01molL氯化钙溶液。 仪器pH计或酸度计；pH复合电极（或pH玻璃电极和甘汞标准电极）。样品处理将土壤样品风干磨细过2mm筛，称取100g样品于50ml烧杯中，加入25ml无二氧化碳的蒸馏水或1molL氯化钾溶液（酸性土壤），或001molL氯化钙溶液（中性和碱性土壤），用玻璃棒剧烈搅拌1-2min，静置30min，以备测定。此时应注意实验室氨气和挥发性酸雾的影响。测定按仪器说明书开启pH计（或酸度计），选择与土壤浸提液pH值接近的pH标准缓冲溶液（酸性的用pH4.01缓冲溶液，中性的用pH6.87缓冲溶液，碱性的用pH9.18缓冲溶液）作为标准，校正仪器指示的pH值与标准值一致。将pH计的复合电极（或pH玻璃电极和甘汞标准电极）插入土壤浸提液中，轻轻转动烧杯，读出pH值。每份样品测定后，用蒸馏水冲洗电极，并用滤纸将水吸干。 计算pH计读出的pH值。 备注 1分析精度01pH值，但精密的pH计可准至002pH单位，并使用温度补偿。2土壤样品不要磨得过细，以2mm筛为宜。磨好的样品如果不能马上测定，应装瓶密封保存，以防的空气中的氨气和挥发性酸影响。电极插入土壤浸提液后轻轻转动烧杯是必要的，可加速平衡时间，这对于缓冲性较弱或pH较高的土壤尤为重要。若用标准甘汞电极作参比电极时，一定要插在上部溶液中，以减少误差。二、有机质的测定仪器、设备及试剂1.仪器与设备硬质试管，油浴消化装置(包括油浴锅和铁丝笼)，可调温电炉，秒表，自动控温调节器。2.试剂 (1)0.800 0molL1重铬酸钾标准溶液：称取经130烘干的重铬酸钾(K2Cr207，分析纯)39.2245g溶于水中，定容至1000mL。 (2)0.2molL-1FeS04溶液：称取硫酸亚铁(FeS047H20，化学纯)56.0g溶于水中，加浓硫酸5mL，稀释至1 L。 (3)指示剂邻啡罗啉指示剂：称取邻啡罗啉(分析纯)1.485 g与FeS047H200.695g，溶于100mL水中。2羧基代二苯胺(o-phenylanthranilicacid，又名邻苯氨基苯甲酸，C13H11O12N)指示剂：称取0.25 g试剂于小研钵中研细，然后倒人100mL小烧杯中，加入0.1molL1NaOH溶液12mL，并用少量水将研钵中残留的试剂冲洗人100mL烧杯中，将烧杯放在水浴上加热使其溶解，冷却后稀释定容到250mL，放置澄清或过滤，用其清液。方法和步骤1.样品制备称取通过0.149mm(100目)筛孔的风干土样0.11g(精确到0.0001g)，分别放人68支干燥的硬质试管中，用移液管准确加入0.8000molL1重铬酸钾标准溶液5mL(如果土壤中含有氯化物需先加(Ag2S040.1g)，用注射器加入浓H2S04 5mL充分摇匀，管口盖上弯颈小漏斗。2.测定 将置于铁丝笼中的810支试管(每笼有12个空白试管)，放人温度为185190的石蜡油浴锅中，并控制电炉，使油浴锅内温度始终维持在170180，待试管内液体沸腾发生气泡时开始计时，煮沸5 min，取出试管，稍冷后擦净试管外部油液。冷却后，将试管内物质倾人250mL三角瓶中，用水洗净试管内部及小漏斗，使三角瓶内溶液总体积达到6070mL，保持混合液中硫酸浓度为23molL1，然后加入2羧基代二苯胺指示剂1215滴，此时溶液呈棕红色。用标准的0.2molL1硫酸亚铁滴定，滴定过程中不断摇动三角瓶，直至溶液的颜色由棕红经紫色变为暗绿(灰蓝绿色)，即为滴定终点。如用邻啡罗啉指示剂，加指示剂23滴，溶液的变色过程中由橙黄一蓝绿一砖红色即为终点。记取Pem4滴定毫升数(y)。每一批样品测定的同时，进行23个空白试验，即取0.5g粉状二氧化硅代替土样，其他步骤与试样测定相同。记取FeS04滴定毫升数(Vo)，取其平均值。3.计算土壤有机碳(g/kg)= c5(V0 - V) /V00.0031.11000/mk式中： c重铬酸钾标准溶液的浓度，molL-1Vo空白滴定用去FeS04体积，mL； 3.01/4碳原子的摩尔质量，gmol-11.1氧化校正系数； m风干土样质量，g； k将风干土换算成烘干土的系数。 土壤有机质(gkg-1)土壤有机碳(kg-1)1.742式中：1.724为土壤有机碳换成土壤有机质的平均换算系数。注意事项含有机质高于50gkg-1者，称取土样0.1 g，含有机质为2030gkg-1者，称土样0.3g，少于20gkg-1者称取0.5g以上。土壤中氯化物的存在可使结果偏高。因为氯化物也能被重铬酸钾所氧化，因此，盐土中有机质的测定必须防止氯化物的干扰，少量氯可加入少量Ag2SO4，使氯根沉淀下来。Ag2SO4的加入，不仅能沉淀氯化物，而且有促进有机质分解的作用。Ag2SO4的用量不能太多，约加0.1g，否则生成Ag2Cr2O7沉淀，影响滴定。必须在试管内溶液表面开始沸腾才开始计算时间。掌握沸腾的标准尽量一致，然后继续消煮5min，消煮时间对分析结果有较大的影响，故应尽量记时准确。消煮好的溶液颜色，一般应是黄色或黄中稍带绿色，如果以绿色为主，则说明重铬酸钾用量不足。在滴定时若消耗硫酸亚铁量小于空白用量的13，有氧化不完全的可能，应弃去重做。三、土壤全氮的测定1 测定原理样品在加速剂的参与下，用浓硫酸消煮时，各种含氮有机化合物，经过复杂的高温分解反应，转化为铵态氮。碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以酸标准溶液滴定，求出土壤全氮含量（不包括全部硝态氮）。包括硝态和亚硝态氮的全氮测定，在样品消煮前，需先用高锰酸钾将样品中的亚硝态氮氧化为硝态氮后，再用还原铁粉使全部硝态氮还原，转化成铵态氮。2.1 土壤样品粉碎机；2.2 玛瑙研钵；2.3 土壤筛：孔径1.0mm（18目）；0.25mm（60目）；2.4 分析天平：感量为0.0001g；2.5 硬质开氏烧瓶：容积50ml，100ml；2.6 半微量定氮蒸馏装置；2.7 半微量滴定管：容积10ml，25ml； 2.8 锥形瓶：容积150ml；2.9 电炉：300W变温电炉。3 试剂3.1 硫酸（GB 62577）：化学纯；3.2 硫酸（GB 62577）或盐酸（GB 62277）：分析纯，0.005mol/L硫酸或0.01mol/L盐酸标准溶液；3.3 氢氧化钠（GB 62981）：工业用或化学纯，10mol/L氢氧化钠溶液；3.4 硼酸-指示剂混合液；3.4.1 硼酸（GB 62878）：分析纯，2溶液（W/V）；3.4.2 混合指示剂：0.5g溴甲酚绿（HG3122079）和0.1g甲基红（HG3958 76）于玛瑙研钵中，加入少量95乙醇，研磨至指示剂全部溶解后，加95乙醇至 100ml。使用前，每升硼酸溶液中加20ml混合指示剂，并用稀碱调节至红紫色（pH值约4.5）。此液放置时间不宜过长，如在使用过程中pH值有变化，需随时用稀酸或稀碱调节之。3.5 加速剂：100g硫酸钾（HG 392076，化学纯），10g五水合硫酸铜（GB 665 78，化学纯），1g硒粉（HG392676）于研钵中研细，必须充分混合均匀。4 土壤样品的制备将通过孔径1mm（18目）筛的土样，在牛皮纸上铺成薄层，划分成多个小方格。用小勺于每个方格中，取等量的土样（总量不得少于20g）于玛瑙研钵中研磨，使之全部通过0.25mm筛。混合均匀后备用。5 测定步骤5.1 称取风干土样（通过0.25mm筛）1.0g（含氮约1mg），同时测定土样水分含量。5.2 土样消煮不包括硝态和亚硝态氮的消煮：将土样送入干燥的开氏瓶底部，加少量无离子水（约0.51ml）湿润土样后，加入2g加速剂和5ml浓硫酸，摇匀。将开氏瓶倾斜置于300W变温电炉上，用小火加热，待瓶内反应缓和时（约1015min），加强火力使消煮的土液保持微沸，加热的部位不超过瓶中的液面，以防瓶壁温度过高而使铵盐受热分解，导致氮素损失。消煮的温度以硫酸蒸气在瓶颈上部1/3处冷凝回流为宜。待消煮液和土粒全部变为灰白稍带绿色后，再继续消煮1h。消煮完毕，冷却，待蒸馏。在消煮土样的同时，做两份空白测定，除不加土样外，其他操作皆与测定土样时相同。5.3 氨的蒸馏5.3.1 蒸馏前先检查蒸馏装置是否漏气，并通过水的馏出液将管道洗净。5.3.2 待消煮液冷却后，用少量无离子水将消煮液定量地全部转入蒸馏器内，并用水洗涤开氏瓶45次（总用水量不超过3035ml）。于150ml锥形瓶中，加入5ml2硼酸-指示剂混合液，放在冷凝管末端，管口置于硼酸液面以上34cm处。然后向蒸馏室内缓缓加入20ml10mol/L氢氧化钠溶液，通入蒸汽蒸馏，待馏出液体积约50ml时，即蒸馏完毕。用少量已调节至pH4.5的水洗涤冷凝管的末端。5.3.3 用0.005mol/L硫酸（或0.01mol/L盐酸）标准溶液滴定馏出液由蓝绿色至刚变为红紫色。记录所用酸标准溶液的体积（ml）。空白测定所用酸标准溶液的体积，一般不得超过0.4ml。6 测定结果的计算6.1 计算公式土壤全氮（）（VV0）CH0.014/m100 式中：V滴定试液时所用酸标准溶液的体积，ml；V0 滴定空白时所用酸标准溶液的体积，ml；CH 酸标准溶液的浓度，mol/L；0.014 氮原子的毫摩质量；m 烘干土样质量，g。6.2 平行测定结果，用算术平均值表示，保留小数点后三位。6.3 平行测定结果的相差：土壤含氮量大于0.1时，不得超过0.005；含氮 0.10.06时，不得超过0.004；含氮小于0.06时，不得超过0.003四、土壤全磷的测定HCLO4-H2SO4钼锑抗比色法：（1）方法要点：在高温条件下，土壤中含磷矿物和有机磷化合物与高沸点的H2SO4和强氧化剂HCLO4作用，使之完全分解，全部转化为正磷盐而进入溶液，然后用钼锑抗比色法测定。（2）主要仪器：分光光度计，2KVA方电炉，3KVA调压变压器。（3）试剂：A浓H2SO4（二级）。BHCLO4（二级，7072%）。C钼锑贮存液。浓H2SO4（二级）153毫升缓慢倒入约400毫升水中，搅拌，冷却。10克钼酸铵（二级）溶解于约60的300毫升水中，冷却。然后将H2SO4溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中，再加入100毫升0.5%酒石酸锑钾溶液，最后用水移释至1升，避光贮存。此贮存液含1%钼酸铵，5.5摩尔/升1/2H2SO4。D钼锑抗显色剂。1.50克抗坏血酸溶液于100毫升钼锑贮存液中。此液须随配随用，有效期一天。E二硝基酚指示剂。0.2克2，6-二硝基酚或2，4二硝基酚溶于1000毫升水中。F5ppmP标准溶液。0.4390克KH2PO4（二级，105。C烘过2小时）溶于200毫升水中，加入5毫升浓H2SO4，转入1升容量瓶中，用水定容。此为100ppmP标准溶液，可以长期保存。取此溶液准确稀释20倍，即为5ppmP标准溶液，此溶液不宜久存。（4）操作步骤：A待测液的制备：称取通过100目的烘干土壤样品1克（精确到0.0001克）置于50毫克三角瓶中，以少量水湿润，加入浓H2SO48毫升，摇动后（最好放置过夜）再加入7072%的HCLO410滴，摇匀，再加热消煮。缓慢升温，HC