平面色谱法课件

平面色谱法 TLC 3 1概述3 2薄层色谱系统3 3薄层色谱参数3 4薄层色谱条件选择3 5薄层色谱的应用 3 1概述 1 薄层色谱法指固定相涂布于平面载体上 流动相通常是借助毛细管作用流经固定相 使被分离的物质保留在固定相上的色谱方法分类纸色谱薄层色谱薄层电泳 纸色谱法 纸色谱是以滤纸为载体的液 液分配色谱 滤纸由纤维素制成 其分子中具有很多羟基 有较强的亲水性 能吸收20 25 的水分 其中6 左右的水分通过氢键与纤维素上的羟基相结合形成的固定相 若要分离非极性物质可用适当的低级性液体如石蜡油 硅油等处理滤纸 流动相 展开剂 与水不相溶 或部分相溶 的溶剂分离原理 与待分离组分无作用 正相色谱 反相色谱 K越大随流动相移动越慢 反之越快 从而实现分离 薄层色谱 将固定相于玻璃或铝箔等载板上涂布成均匀的薄层 展开剂 流动相 借助毛细作用从薄层板点样的一端展开到另一端时使不同物质得到分离 分离原理随固定相不同而异 基本与柱色谱相同 可分为吸附薄层 分配薄层 离子交换薄层以及凝胶薄层等 固定相种类多样 显色剂选择及载样量均较纸色谱大 而切割色谱带较柱色谱方便 因此在分离分析及小量制备工作中最为常用 薄层电泳 电泳法指在一定电场作用下 荷电粒子 如蛋白质 核苷酸 多肽 糖类等 在纸 醋酸纤维素 琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等惰性支持介质上 因粒子大小及荷电种类 数量不同 向两极以不同速度迁移而得到分离的方法 对分离后的组分洗脱后测定或直接扫描可进行定性或定量分析 驱动力来源 仪器设备及测定对象与纸色谱 薄层色谱差别较大 暂不一起介绍 3 1概述 2 平面色谱法的特点 仪器自动化程度 分辨率及重现性不及GC HPLC一次性的固定相 对样品预处理要求不高 展开剂用量少 经济环保固定相 特别是流动相选择范围宽 有利用不同性质化合物的分离 因此对待分离组分没有太多限制具有多路柱效应 可同时平行分离多个样品 3 1概述 3 对成份复杂的试样可采用不同类型的流动相双向展开 提高分离效能可根据各组分的性质选择适当的显色或检测方法进行定性定量分析试样全部组分均停留在平面上 不会造成检测失落 对未知试样的分析很有利 可随时对谱图测定以获得最佳结果 直观性 可比性极强现代化薄层色谱采用高效薄层板 且在每步操作均有相应的仪器代替手工 使得定量分析的准确度和重现性大大提高设备简单 操作方便 是一般实验室必不可少的分离分析手段 双向纸色谱法 例 氨基酸混合液点在15 15cm滤纸边2cm处 风干 展开剂用CH3OH H2O 吡啶 20 5 1 当溶剂移动至14cm处 取出风干 第一次展开 第一次展开第二次展开 将滤纸折成筒状 使斑点处于下方 再用叔丁醇 甲基乙基酮 H2O 二乙胺 10 10 5 1 展开14cm 取出风干 第二次展开 显色 茚三酮 4 乙 2 甲氮苯 冰HAc 3 1概述 4 TLC与HPLC的比较固定相与流动相样品的预处理进样色谱分离定量 固定相与流动相 HPLC流动相线速恒定流动相选择受限固定相与流动相性质影响峰形和分离度定距洗脱色谱 并非所有组分都能被检测 分析时间不可控柱子反复使用 TLC薄层板各处流量不同流动相选择限制小吸附剂性质和流动相毛细管运动情况影响分离度定时展开色谱 色谱图上各组分均能被检测 分析时间可控薄层板一次使用 分离过程无交叉污染 多样品同时分离 样品预处理 HPLC防止色谱柱被污染 预处理过程复杂而严格 TLC固定相是一次性的 因此可不需预处理 但如待测组分含量太低 杂质太多影响待测组分的分离或干扰薄层板背景时可采用萃取 吸附及衍生等方式进行处理可用作HPLC前的预分离富集 进样 HPLC对溶样溶剂及样品浓度有严格要求可自动进样 每次一个样品 TLC溶样溶剂可任意选择 点样体积是唯一需要严格控制的参数可自动进样 每次可多个样品 色谱分离 HPLC每次进一个样 分析和平衡时间长恒组分洗脱适用极性范围窄的样品 梯度洗脱适于极性范围宽的样品并需要更多的时间反相色谱法最常用使用相同固定相和流动相时重现性较高 TLC同时分析多个样品 方便灵活1适于各类物质的分离11正相 吸附 色谱占主导对复杂样品分离能力好 定量 HPLC均相液体 符合比尔定律1在线检测 线性范围宽 TLC不透明液体 不符合比尔定律 需溶解后定量离线检测 大量样品分析时方便快捷原位测定 薄层扫描仪 普遍采用紫外 可见检测器 薄层扫描仪的应用 1 黄连中小檗碱含量的荧光扫描测定 定量 甲苯 醋酸乙酯 甲醇 异丙醇 水 6 3 2 1 5 0 3 氨蒸气预平衡 线性范围 18 28ng 329 04ng回归方程 IF 720 146 34 942mr 0 998 薄层扫描仪的应用 2 巴比妥盐的三维紫外光谱 薄层色谱图 定性 与标准品的紫外吸收图比较 在Rf相同的前提下 提高定性可靠性 3 1概述 5 平面色谱法操作流程 吸附剂或载体的选择及薄层的制备 滤纸或薄层板的处理 点样 样品制备 色谱前衍生化 滤纸或薄层板预平衡 展开 定位 定性 定量 3 1概述 6 薄层色谱法的基本材料及设备滤纸及薄层板 自制或市售 涂布器点样器 定性 普通毛细管 定量 微量注射器或微量定量毛细管 展开室显色器薄层扫描仪 3 2薄层色谱系统 薄层材料未改性固定相改性固定相载板粘结剂荧光指示剂 薄层色谱操作过程薄层板的制备 铺板 活化点样展开定位 洗脱 薄层材料 1 未改性固定相硅胶 最常用极性吸附剂 具有表面吸附活性中心 略带酸性氧化铝 常用极性吸附剂 具表面活性 略带碱性硅藻土 中性吸附剂纤维素 液液分配色谱担体 水为固定相 具有一定粘性聚酰胺 特殊有机薄层材料 薄层材料 2 表面改性固定相疏水改性硅胶 烷基键合硅胶 疏水性随烷基链长和改性程度增加而加强 反相色谱采用高含水溶剂系统 需低改性硅胶 使溶剂体系在较大范围内可调 增加色谱选择性 亲水性改性硅胶 介于极性和疏水性改性吸附剂间的色谱选择性 极性排序 硅胶 氨基 氰基 二羟基表面改性纤维素 乙酰化纤维素 乙酰化程度可变 薄层材料 3 载板具有一定机械强度 化学惰性 耐一定温度 表面平整 厚度均匀 价格便宜玻板 5cm 10cm 10cm 20cm 20cm 20cm光滑 平整 洗净后不附水珠 干燥 薄层材料 4 粘结剂加强固定相颗粒的附着力 增加薄层板润湿性 改善色谱分离无机粘结剂 煅石膏有机粘结剂 羧甲基纤维素钠 CMC 0 8 CMC溶液配均浆涂铺的薄层板强度高 色谱分离性能好注意 不适合浓硫酸显色 易霉变降解 硅胶G 含13 15 煅石膏制备硅胶G 含30 煅石膏氧化铝G 含9 煅石膏硅胶H 不含粘结剂 薄层材料 5 荧光指示剂适当波长激发光照射下可产生均匀的荧光背景 清晰显示化合物暗斑用量 1 5 2 0 短波荧光指示剂 254nm紫外光激发发出荧光譬如锰激活的硅酸锌长波荧光指示剂 366nm紫外光激发发出荧光譬如银激发的硫化锌 硫化镉 五味子提取物TLC 石油醚 30 60 甲酸乙酯 甲酸 15 5 1 254nm 举例 硅胶H 不含粘合剂硅胶G 硅胶和煅石膏混合而成硅胶HF254 不含粘合剂 含荧光指示剂254nm波长照射下呈现荧光背景硅胶GF254 同时含粘合剂和荧光指示剂254nm波长照射下呈现荧光背景硅胶HF254 366 不含粘合剂 含荧光指示254nm和356nm波长呈现荧光背景 薄层色谱操作过程 1 薄层制备 铺板 1份吸附剂 硅胶 氧化铝 3份粘合剂 水 搅拌至均匀糊状 无气泡和板结 均匀涂布薄层板硅胶G 自含粘合剂 含5 10 煅石膏 仅加水硅胶H 不含黏合剂 需另加CMC 0 4 1 澄清水溶液 预制板效果最佳 贵 用涂布器自制亦可 薄层色谱操作过程 2 活化将晾干后的薄层板置于110 C烘30min 放在干燥器中备用吸附剂活性越强 活性级别越低 最好为2 3级 共5级 赫曼尼柯法测定活性偶氮苯30mg对甲基偶氮苯 苏丹红 苏丹黄 对氨基偶氮苯各20mg 溶于50mLCCl4中配成实验溶液 在氧化铝或硅胶薄层上 以CCl4为展开剂展开 然后计算各染料组分的比移值 对照参照表确定薄层活性 预制板及非吸附原理的薄层板不要活化 薄层色谱操作过程 3 点样 成功分离和精确定量的关键点样要求 点样远点应小而圆 距板边缘2cm需要时可多次点样 前次点样溶剂挥干 防止边缘效应点样量无超载 防止拖尾点样勿伤及薄层表面点样装置 容量毛细管 自动薄层点样仪等 薄层色谱操作过程 4 展开展开原理 差速迁移展开方式 上行展开 最常用 还有其它多种形式展开过程 展开室预先用展开剂饱和 平衡系统 点样薄板一段浸入展开剂 原点不能没入展开剂 展开 溶剂前沿距边缘0 5 1cm时终止 挥尽溶剂 溶剂蒸气的影响 未经溶剂蒸气预平衡 展开室预先用溶剂蒸气平衡 人参皂甙的薄层色谱 展开溶剂的蒸气也参与色谱展开的全过程 固相 板上的吸附剂如硅胶 液相 展开剂 气相 溶剂蒸气三相相互作用 相对湿度的影响 苍术提取物薄层色谱图 可用浓硫酸 水体系调节 温度的影响 淫羊藿薄层色谱 宝藿苷 薄层色谱操作过程 5 定位 洗脱定位方法光学检出法 荧光显示 荧光淬灭蒸气检出法 碘蒸气法 可逆 不可逆反应 试剂显色法 喷雾显色法 浸渍显色法洗脱方法取下TLC上分离的斑点 用溶剂将化合物的斑点从吸附剂上定量洗脱下来 收集洗脱液并用适当方法测定 拍照 最佳数据保存方法 连翘薄层色谱 3 3薄层色谱参数 定性参数及于相平衡参数关系比移值 相对比移值板效参数理论塔板数 理论板高分离评价参数分离度 分离数 定性参数及于相平衡参数关系 1 比移值 溶剂前沿 起始线 原点 展开剂 有颜色或显色 同一物质在相同薄层条件下Rf值相等 定性参数及于相平衡参数关系 2 相平衡参数分配系数分配比 保留因子 容量因子 与温度 组分及两相性质有关 K值不同分离的前提 Vm 薄层板中流动相的体积Vs 不同模式色谱含义不同 分配色谱中指固定相的体积 衡量薄层板对待测组分保留能力的重要参数 定性参数及于相平衡参数关系 3 比移值与相平衡参数关系推导 设展开剂流速为u 则组分的平均流速 设展开时间为t 则 薄层条件确定情况下 K k R 组分难洗脱 关于Rf的几点讨论 1 Rf与K和k有关 即与组分性质 薄层板和展开剂性质有关色谱条件一定 Rf只与组分性质有关 TLC定性参数 K k R 组分难洗脱改变展开剂极性可以改变K和k 进一步改变RfRf 0 K 组分极性过大 不展开 可增加展开剂的极性 如仍不能提高Rf 则组分极性过高 可更换低活性硅胶板或用反相薄层板以增大Rf 关于Rf的几点讨论 2 Rf 1 K 0 组分极性过小 不吸附 可降低展开剂极性 或增加硅胶的吸附活性 降低Rf对于极性组分 当采用硅胶吸附薄层板时 展开剂极性 k R 容易洗脱 展开剂极性 k R 不容易洗脱 Rf范围 0 Rf 1 Rf0 2 0 8 常用 Rf0 3 0 5 最佳 定性参数及于相平衡参数关系 4 相对比移值Rx讨论 相对比移值Rx与组分和参考物性质 溶解度等 及色谱条件有关 范围可以大于或者小于1由于参考物与待测物采用完全形同的色谱条件展开 可以消除系统误差 大大提高结果的重复性和可靠性参考物既可以是加入样品的纯物质 亦可以是样品中某一已知组分 板效参数 理论塔板数理论塔板高度 D 原点到组分斑点中心的距离W 组分斑点的宽度 代表色谱柱分离效能的指标 平面色谱的n值只要取决于色谱系统的物理特性如吸附剂粒度 均匀度 活度 展开剂流速及展开方式等 L 原点到展开剂前言的距离 分离评价参数 1 分离度 分辨率 两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度 直径 的比值 TLC分离度与比移值关系 影响TLC分离的影响因素 1 色谱分离方程柱效 取决于吸附剂的性能主要影响斑点的分散程度 n 斑点集中 R 选择性因子 取决于展开剂 及吸附剂 种类与组成应选择适宜的流动相和活性适宜的薄层板使 1使性质接近组分的K产生较大差别是分离条件优劣的量度 影响TLC分离的影响因素 2 容量因子k 取决于展开剂的极性最佳分离条件Rf 0 3 0 5 可用范围0 2 0 9调整展开剂的极性或改变薄层板的活性 可使得被分离组分的Rf落在需要空间 分离评价参数 2 分离数SN a 近似等于原点到溶剂前沿的距离W0 1 2 和W1 1 2 表示Rf 0和1的斑点宽度的一半 在相邻斑点分离度为1 177时 在Rf 0 1两组分斑点间所能容纳的斑点个数 SN是衡量TLC分离容量的重要技术参数 斑点越集中 在相同展距中能分离的组分数越多 表明板效越高 色谱板的容量越大经典薄层板的SN7 10 高效薄层板SN10 20 3 4薄层色谱条件选择 溶剂对洗脱强度的影响溶剂对分离度的影响薄层板活度级别选择吸附薄层板溶剂系统选择步骤TLC色谱条件选择原则TLC展开系统的溶剂优化 溶剂对洗脱强度的影响 吸附色谱和正相分配色谱溶剂极性越大 溶剂强度越大 洗脱能力越强对于反相分配色谱溶剂极性越大 溶剂强度越小 洗脱能力弱 溶剂对分离度的影响 溶剂的极性影响Rf或k 溶