基因测序实验常见问题分析

技术支持部 实验常见问题解析 出现问题的类型 光谱校正时出现的问题电泳时出现的问题基因分型时出现的问题其它在出差中遇到的问题 一 光谱校正时出现的问题 1 软件提示 Insufficientnumberofdyespectradetected Checkrawdata 1 实际原因 泳道没有收集到信号 即没有检测到目的峰 或目的峰信号过低 低于750rfu 解决方案 如有必要重新校正则减少与甲酰胺的比例 或增大进样时间 2 软件提示 Saturateddatadetected Calibrationfailed 实际原因 气泡引起的峰使信号达到饱和 显示不通过 解决方案 尽量保证胶及通道中没有气泡 下图是放大图 3 软件提示 Baddyeorderdetected 实际原因 引物峰过高 检测范围包括引物峰部分 解决方案 调整检测范围到引物峰之后 包括所有目的峰 4 软件提示 Failedqualitycheck q 0 93807islessthanminQthreshold 0 95000 实际原因 各颜色之间引起的pullup和pulldown峰导致Q值低于设定值 解决方案 权宜之计是降低Q值设定值 彻底解决就是重新生产matrix 5 选择了不适合Dyeset的Module 二 电泳时出现的问题 1 所有毛细管没有数据原因 毛细管或block通路中有气泡没有样品进入自动进样器不在正确位置 使毛细管头吸入气泡或接触不到样品措施 重新正确上样 排气泡 拆毛细管清洗block syring 更换胶 2 个别毛细管无信号原因 自动进样器不在正确位置 用20 l样品试验 样品管是中空的 离心 毛细管有弯曲或有损坏 更换毛细管 3 信号过饱和原因 上样量过大 稀释样品 减少进样时间 4 信号过低表现为信号很弱 内标只有几十rfu 原因 甲酰胺质量不高使用的水中盐离子浓度过高 更换超纯水 没有足够的样品 增加上样量 校正自动进样器 样品稀释倍数过大混合的不充分 充分混合 离心 自动进样器不在最佳位置 5 基线不平 峰形明显异常 原因 胶中可能有污染物 清洗block syring 更换胶 胶中有结晶或沉淀物 将胶在室温放置30min使之达到室温 旋动使沉淀物溶解 光谱校正的不好 6 信号凌乱 有倒峰原因 所选的dyeset不适合光谱校正的不好 7 无电流或电流异常 原因 使用的水质量不好 更换超纯水 buffer槽中是水或buffer稀释的倍数不对阳极没有足够的bufferblock或毛细管中有气泡 排气泡 胶已失效整个体系中有泄漏的地方 8 小于100runs毛细管检测结果不好原因 样品本身不好甲酰胺质量不好buffer稀释的倍数不对9 检测的结果异常 移动的快或慢原因 注射器中有水导致胶被稀释block或胶中有大气泡整个体系中有泄漏的地方甲酰胺的质量不好 10 有一根毛细管电泳时背景有荧光 导致基线不平 影响结果 原因 毛细管中有污染物 会随电泳次数增多逐渐消失 处理办法 不加甲酰胺 每次加10 l的蒸馏水 电泳几次 11 每次电泳时并不是全部泳道信号都很好信号弱或无信号的泳道主要集中在两端 解决方法 换成20 l体系试试 调整自动进样器尤其是Z轴 连续多次上样看是否是某根固定毛细管 或者是毛细管有题 或许与所用的96孔板有关 更换96孔板 12 泳道中间基线明显形成一个台阶 说明 属于正常现象 可能是样品中有一些物质导致的 与样品的纯度有关 但并不影响判型 分析样品是会计算调整基线 13 电泳导致大片段峰形变宽 说明 随着时间的推移片段越来越大 所形成的峰变宽 但过宽会影响分型 可能与试剂的纯度有关 注 电泳时胶图 注 分析时图像 14 电泳时易出现尖锐的四种颜色都有的峰 多显示为红色 说明 胶中有气泡 离子 杂质颗粒或其他有机物不透光 发生全反射导致的 解决方案 灌胶前放置室内半小时平衡室温 离心 注意排净气泡 注意环境的洁净程度 注意操作 以减少杂质进入 15 电泳时出现目的片断以外的其他杂峰 原因 主要原因是甲酰胺质量不好 或者是甲酰胺长期在4度放置有降解 解决方案 更换质量好的甲酰胺 确定不是扩增产物 16 出现电泳峰 说明 所出现的尖锐的小峰实际上是四种颜色都有的 位置不固定 杂乱无章 内标中相对明显 影响分析结果 当室温过高时明显会增多 可能是胶中有气泡 受热膨胀 易形成 严重影响分析结果的建议重新电泳 17 其他常见的电泳不好的现象 说明 内标峰值很低 样品峰值低不能作为扩增不好的依据 需要重新上样以确定原因 说明 内标并不均匀 大片段明显变低 可见是电泳结果不好 样品的峰形不能作为扩增好坏的依据 需要重新上样来确定 说明 可见所有峰的峰形异常 不能正确进行分型 是电泳异常的表现 需重新上样 说明 变性不完全现象 更换质量好的甲酰胺 在上样前变性95 C3min 说明 如果校正时跑出如图的峰型 是电泳现象 与产品质量无关 更换质量好的甲酰胺 重新进行校正 说明 上图现象是电泳中出现的现象 在校正正常且多数通过情况下 更换质量好的甲酰胺 上样前变性 重新电泳 与产品质量无关 总结 检测结果不好时 对照现象查找原因 主要注意 1 使用超纯水2 有足够的buffer 且稀释倍数 放置位置准确3 保证block通路中没有气泡 如需要请仪器负责人解决4 加入适量样品如要加微量则有必要稀释 进样时间要适当 如不能更改则调整上样量 使峰高在1000 3000rfu左右 5 使用96孔板上样时如样品太多又复杂则应事先写好记录 加样后振荡 离心变性后立即冰浴3min6 注意毛细管的使用次数 在instrumentprotocol处可见 注意毛细管不要脱离buffer超过30min7 如有离子影响结果 可用水上样试一次8 注意甲酰胺的质量 三 基因分型时出现的问题 分析及解答 从图1可以看出 在样本的每个位点上都有两个或两个以上的目的峰 并且目的峰之间峰值很不均衡 这些都说明这是一个混合样本 等位基因间峰值不均衡是因为不同来源的模板浓度不同导致 如果样本实际上应该是单一来源的 则说明在DNA提取或扩增的过程中污染了其它的DNA 需重新提取DNA或扩增 1 有额外的杂峰 并且每个位点均有杂峰 2 只在一个位点或几个位点出现了额外的杂峰 分析及解答 图中 D21位点明显污染了ladder 这可能是由于检测过程中污染了D21ladder的片段 3 在个别位点出现的不同于目的峰的染料堆积峰 偶尔会在本实验室出现的染料堆积峰 vWA位点 D18位点附近 4 峰值过高 5 pull up或pull down峰 分析及解答 当峰值过高 大于4000rfu 或matrix校正不好时 都可能会观察到在某一颜色中出现由另一颜色的信号而拉起 pull up 或减低 pull down 的峰 如果峰值过高 可以在上样前先将PCR产物进行稀释 这样电泳时峰值就会下降 pull up或pull down峰就会减轻 如果峰值小于2000rfu还是出现pull up或pull down峰 则说明是matrix校正不好 需要重新进行校正 6 位点丢失 分析及解答 图中出现了明显的位点丢失现象 这是由模板量较低或模板已降解造成的 DNA降解成为较小的片段 故相对长些的片段无法得到扩增 7 峰值低 影响分型 分析及解答 峰值较低 可能是模板DNA的量不足 或者是模板DNA中存在较多的抑制剂 而样本中较多的离子或EDTA都会影响PCR扩增的效率 此时可以增加模板的用量 增加反应的循环数 但要注意的是 模板DNA的体积不要超过总反应体积的20 否则其中的抑制剂会抑制扩增反应 8 小片段位点优势扩增而大片段位点扩增效率低 分析及解答 图中是一个明显的小片段优势扩增而大片段扩增效率低的图例 这种现象经常见于含量过大的DNA模板 ABI的ID试剂盒此种现象更为明显 可能是因为当模板过多时 体系中的聚合酶 dNTP等资源被小分子量片段 因其较易扩增 优先利用 而大分子量的片段得不到足够的资源来高效扩增而导致的 若想改善这种状况可以适当减少模板的用量 并降低反应的循环数 9 等位基因峰高失衡 分析及解答 图中峰值很低 等位基因间峰高失衡 以至于难以判型 当模板量过少时 得到的PCR产物较少 等位基因与噪音峰在峰值上相差不多 无法判断是等位基因型还是噪音峰 导致无法准确判型 10 加A不完全 A A 分析及解答 TaqDNA聚合酶可以不依赖于模板的方式在扩增产物的3 末端加核苷酸 一般是腺苷酸 发生这一现象的频率取决于不同的引物序列和聚合酶的性质 因此有时能观察到比预计少一个碱基的假带 本试剂盒已将引物序列进行修饰 并在扩增程序的最后一步加入60 延伸30分钟的步骤 尽量使PCR产物末端都加上A 11 扩增良好的样本的图例 1 Panel不能导入 弹出的对话框显示为 Invalidmarkerrepeatinline 5formarkerAmlogeninvalidmarkerrepeatare2 3 4 9 四 在出差中遇到的问题 2 染料堆积峰 Amlogenin vWA D13S317 TH01位点 3 不同颜色峰峰高均衡性差 28个循环 chelex提取 滤纸上的血斑和唾液斑 4 TPOX位点前存在非特异性峰 5 电泳中产生的问题 1 OffLadder现象原因 多个run的Ladder之间相互影响 有聚集偏移倾向 Ladder峰偏离了Bin 样品峰也偏离了Bin 这种情况之下将样品和相对应的Ladder重新建立project 重新分析 如果能对应就不必重新扩增 2 两个等位基因峰合在一起 电泳分辨率下降 缓冲液PH值改变或胶时间过长 下图为正常现象 3 Ladder中75bp处杂峰 6 在进行PCR扩增时引物震荡不够充分 当引物震荡不够充分时 会导致两种现象 一是不同染料标记物之间峰高不均衡 二是同一染料标记得位点峰高不均衡 7 不