医学硕士研究生开题报告范文_2

神经元形成 干细胞增殖 星形胶质细胞和细胞凋亡的在各发育阶段人胚胎脊髓中的检测 导师XX教授研究生XX CompanyLogo 一 课题名称 神经元形成 干细胞增殖 星形胶质细胞和细胞凋亡的在各发育阶段人胚胎脊髓中的检测二 研究目的及意义三 立论依据和国内外研究现状四 实验方法1 动物和试剂2 仪器3 实验详细步骤 CompanyLogo 五 预期目标六 已具备条件和个人条件七 前期工作基础 可行性 八 研究工作的主要阶段 进度和完成时间九 经费预算十 实验风险及前景分析 CompanyLogo 一课题名称 NeuN nestin GFAP在人胚胎脊髓发育过程中的表达及凋亡细胞的检测二研究目的及意义 目的 1 检测nestin GFAP NeuN在人胚胎脊髓各个发育阶段中的表达及变化 2 不同发育阶段的人胚胎脊髓中凋亡细胞的检测 CompanyLogo 意义 检测在人胚胎脊髓中神经干细胞 神经元 星形胶质细胞 凋亡细胞的时空变化规律 探讨其在人胚胎脊髓发育过程中的机制 脊髓发育缺陷的机制 以期为人类胚胎脊髓的发育规律 脊髓损伤后的治疗 修复提供理论依据 CompanyLogo 三立论依据和国内外研究现状1 脊髓损伤严重威胁人们的健康和生活质量 被视为临床治疗的难题 脊髓损伤后的修复一直是神经科学研究领域的一大难题 近年来神经干细胞的发现及其相关研究为脊髓损伤的治疗提供了一种新的策略 CompanyLogo 神经干细胞的生物学特性为 1 GageFH 2000 能分化为神经组织或来源于神经系统 具有自我更新能力 通过非对称分裂产生新的细胞 神经干细胞存在于中枢神经系统的各个发育阶段 在胚胎神经发育过程中 神经干细胞的繁殖发生于神经管相连的中央管表面 2 马以骝 2001 CompanyLogo 神经干细胞由胚胎早期的室管膜上皮产生且具有多向分化潜能 可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化成逐渐变小的子细胞 最终产生神经元细胞 星形胶质细胞和少突胶质细胞 3 CataudellaT 2004 CompanyLogo 神经巢蛋白 neuroepithelialstemcellprotein Nestin 是Hockfield和Mckay于1985年首先发现的第 类中间丝蛋白质 主要在胚胎期神经前体细胞和神经干细胞呈一过性表达 主要定位于细胞质 是未分化状态多能神经干细胞的标志性抗原 CompanyLogo Nestin表达起始于神经板的形成 随着神经干细胞的不断分化 最终成为成熟的神经元和胶质细胞时 巢蛋白分别被神经丝 neurofilament NF 蛋白和胶质纤维酸性蛋白 GFAP 等所取代 4 HockfieldS 1985 许多动物实验表明在中枢神经系统的不同发育阶段 神经干细胞与神经元和神经胶质细胞是同时并存的 其比例随着胚龄的增长而发生变 5 ConradAM 2002 CompanyLogo 2 胶质细胞是神经系统中除神经元外的另一类细胞成分 数量上胶质细胞远多于神经元 有报道CNS内胶质细胞与神经元的数目之比为10 1 50 1 星形胶质细胞约占正常成人中枢神经系统细胞总数的40 星形胶质细胞在中枢的作用不仅仅是保护 营养和支持 还参与血 脑屏障的 CompanyLogo 构成 水的转运 递质的代谢和释放 离子平衡的维持等 6 8 VanDcGraaff 1998 SulyoklE 2004 朱长庚 神经解剖学 胶质纤维酸性蛋白 glialfibrillaryacidicprotein GFAP 是构成神经胶质细胞的主要细胞骨架蛋白 其表达的高低可以反映胶质细胞的功能状态 9 BiginiP 2001 CompanyLogo 活化的星形胶质细胞内GFAP的增高 可能起保护神经元的作用 星形胶质细胞在损伤区分泌多种神经营养因子 以促进中枢神经和周围神经轴索的生长和存活 10 JCdelaTorre 2002 CompanyLogo 3 在神经系统发育中一个引人注目的现象就是伴随着细胞生长分化的同时也发生大量的细胞死亡 发育中出现的这种由细胞内特定基因程序性表达介导的细胞死亡称为程序性细胞死亡 programmedcelldeath PCD 有人估计胚胎时期产生的神经元在向成体发育过程中通过PCD几乎丢失了50 80 CompanyLogo 很多研究表明PCD存在于神经系统发育的多个环节 11 NaruseI 1995 从未分化的神经上皮到迁移后的有丝分裂后细胞 从神经管的形成 12 李泽桂 1999 到神经元与靶区的匹配都有PCD发生 凡不能与靶区正确匹配和参与正常神经网络形成的神经元均通过PCD加以清除 13 HommaS 1994 CompanyLogo 四实验方法4 1动物和试剂收集从3周到8个月共15个时段的人胚胎脊髓标本81例 所需试剂 封闭用正常羊血清 原液 厂家 北京中杉金桥生物技术有限公司批号 ZLI 9020 CompanyLogo 配制方法 封闭用正常血清原液可用PBS或TBS稀释成5 10 即1 10 1 20倍稀释 后使用 3 H2O2厂家 天津市化学试剂三厂批号 050905配制方法 30 H2O250ml 蒸馏水450ml CompanyLogo Nestin NeuN GFAP抗体Nestin Chemicon公司 批号MAB5326 NeuN Chemicon公司 批号MAB377 GFAP Upstate公司 批号07 650 20 冰箱保存 稀释后4 保存PV 9000免疫组化试剂盒厂家 中杉公司Lot 509102 8 保存 CompanyLogo DAB显色液 ZLI 9032 批号 13861842 8 保存PBS缓冲液柠檬酸盐修复液TUNEL POD试剂盒厂家 Roch公司批号 11684817910 CompanyLogo 4 2仪器或设备 1 高压锅 厂家 潮安县顺发五金制品有限公司批号 xk16 203 00048 2 显微镜 厂家 Olympus批号 XS 212 201 CompanyLogo 3 LX 100手掌型离心机厂家 江苏海门麒麟医用仪器厂 4 HT 200微量电子天平厂家 成都善瑞逊电子有限公司 5 LX 100手掌型离心机厂家 江苏海门麒麟医用仪器厂 CompanyLogo 4 3附助器皿 试剂及常规设备 手术器械 10 中性甲醛 系列脱水缸及脱蜡缸 包埋盒 切片架 耐高温切片架 湿盒 4 冰箱 20 冰箱 37 恒温箱 60 烤箱 洗瓶 PAP划圈笔 CompanyLogo 3 实验详细步骤 1 取材 2 固定 3 制作石蜡切片 放入包埋盒中已固定好的组织用自来水冲洗24小时 为了把甲醛除去 脱水 透明 浸蜡 切片 切成5 m厚的切片 贴片 载玻片经过防脱片处理 CompanyLogo Nestin NeuN GFAP免疫组化步骤 1 石蜡切片进行常规脱蜡 水化 二甲苯 10min 二甲苯 10min 无水乙醇10min 95 乙醇5min 90 乙醇5min 80 乙醇5min 70 乙醇5min 蒸馏水 3 5min 蒸馏水 3 5min CompanyLogo 2 抗原修复 1 高温高压抗原修复 取适量的柠檬酸盐缓冲液 PH6 0 于压力锅中 缓冲液的量必须能足够浸没整个切片 放置于电磁炉上加热至沸腾 将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温染色架上 放入已沸腾的缓冲液中 CompanyLogo 盖上锅盖扣上压力阀 继续加热至喷汽 扣阀至喷汽以4 6min为佳 时间到 压力锅离开热源 稍置数分钟后 用自来水冲淋使之冷却 去阀开盖 室温放置20min 自然冷却后取出切片 2 微波抗原修复取适量柠檬酸盐缓冲液 PH6 0 于烧杯中放入微波炉里加热至沸腾 将脱蜡 CompanyLogo 后置于耐高温切片架上的切片放入沸腾的柠檬酸缓冲液中继续加热10min即可 取出烧杯 室温中通风处放置20 30min 自然冷却后取出切片 3 用0 01MPBS冲洗2 3min 3 H2O2去离子水浸泡10min 以阻断内源性过氧化物酶活性 PBS冲洗3次 每次5min CompanyLogo 4 5 羊血清室温下封闭30分钟 5 甩去羊血清 不洗 直接在切片组织上滴加适量稀释的抗体 Nestin NeuN GFAP一抗 置于4 冰箱过夜 切片置于湿盒中 6 次日上午把切片从冰箱中取出 先在室温中放置30min 以使切片适应室温 CompanyLogo 7 0 01MPBS冲洗3次 每次5min 除去PBS 用力甩去 每张切片上加一滴试剂1 中杉公司的免疫组化试剂盒PV 9000 室温下孵育20min 8 0 01MPBS冲洗3次 每次5min 除去PBS 切片上滴加试剂2 PV 9000 室温下孵育30min CompanyLogo 9 0 01MPBS冲洗3次 每次5min 除去PBS 切片上滴加新配制的DAB显色液 不时在显微镜下观察显色情况 切片浸入蒸馏水中以中止显色 10 切片中止显色后 流水冲洗10min 11 脱水 透明 12 中性树胶封固 CompanyLogo 细胞凋亡原位检测的步骤 采用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒1 石蜡切片常规脱蜡至水 2 新鲜配制3 H2O2 室温处理15min 0 01MPBS液洗涤5min 3次 CompanyLogo 3 切片上滴加消化液 10mMTris Hcl995ul加入1mg mlProteinaseK新鲜稀释至5ug ml 37 消化20min 0 01MPBS洗5min 3次 4 新鲜配制通透液 4 孵育20min或室温孵育8min 0 01MPBS洗5min 3次 CompanyLogo 通透液 取20XSSC20ul TritionX 1004ul 45 50 预热 加单蒸水3 98ml 定容至100ml 充分均匀 5 标记甩去切片上多余液体 标本片擦干组织及周边水分 按每张切片滴加1液和2液 1 9 混合均匀 配成TUNEL反应混和液 冰上操作 CompanyLogo 阴性对照组只加入试剂2液 而不加1液 标本上覆盖塑料盖片 置样品于湿盒中 37 标记1h 后4 过夜 20h以上 0 01MPBS洗5min 3次 6 滴加5 牛血清白蛋白封闭液 室温中30min 甩掉封闭液 不洗 CompanyLogo 7 转化剂 POD50 l 片滴加至标本片上 置样品于湿盒中 37 孵育40min 0 01MPBS洗5min 3次 8 DAB显色 室温5 10min 单蒸水中止显色 流水冲洗10min 9 脱水 透明 封片 CompanyLogo 五预期目标1 检测不同发育时期的人胚胎脊髓中Nestin NeuN GFAP的表达及变化 2 检测不同发育时期的人胚胎脊髓中细胞凋亡的情况 3 探讨脊髓内神经元 神经干细胞 星形胶质细胞与细胞凋亡高峰出现的时间点有何相关性 CompanyLogo 六已具备的条件1 本研究所下属三个实验室 组织化学实验室 细胞室和分子生物学实验室 可开展从形态至分子生物学技术的相关研究 2 导师李力燕教授和王廷华教授多年来从事神经科学的研究 尤其在脊髓发育的研究方面积累了丰富的经验 可提供宝贵的理论和实践指导 CompanyLogo 七前期工作基础 可行性 1 本研究所具有专门的分子室 细胞室 免疫组化室 且各项技术都很成熟 2 已完成了神经营养因子家族与受体 包括NGF BDNF NT 3 NT 4 TrkA TrkB TrkC 在人胚胎脊髓中的免疫组化染色 3 掌握了免疫组织化学 原位杂交 H E染色的实验技术 CompanyLogo 八研究工作的主要阶段 进度和完成时间1 实验所需标本已制作完成2 2007 11 2008 1开始做预实验及正式实验3 2008 1 2008 4观察结果 图像分析统计 撰写论文 CompanyLogo 九经费预算1 nestin NeuN GFAP三个抗体价格Anti NeuN 3437 50元 chemicon公司 Anti nestin 3000元 chemicon公司 Anti GFAP 3737 50元 Upstate公司 CompanyLogo 2 免疫组化试剂盒第二代通用型二步法检测系统 北京中杉公司 PV 9000 320 00元 3 0ml3 细胞凋亡原位检测试剂盒 TUNEL Roche公司4600元4 封闭用正常羊血清 原液 北京中杉公司 ZLI 9020 45元 10ml CompanyLogo 5 其他常规试剂约200元 十实验风险及前景分析1 由于实验对象是人胚胎标本 无法及时灌注固定 故有可能导致标本固定不及时不充分 从而使组织结构不完整 损失一部分抗原等 CompanyLogo 2 实验结果与预期不符这就要求我们从标本固定取材开始直至后续的免疫组化染色和原位凋亡细胞的检测都严格操作 不忽视每一个环节 每一个步骤 试剂准备充分 实验设计合理 实验操作熟练 准确 努力将实验风险控制到最小程度 CompanyLogo 参考文献 1 GageFH Mammalianneuralstemcells J Science 2000 287 1433 1438 2 马以骝 杨志敏 王秦秦等 大鼠胚胎神经干细胞定位及干细胞克隆实验研究 立体定向和功能性神经外科杂志 2001 14 2 63 69 3 CataudellaT ContiL CattaneoE Neuralstemandprogenitorcells choosingtherightShc ProgBrainRes 2004 146 127 133 4 HockfieldS MckayRD Identificationofmajorcellclassesinthedevelopingmammaliannervoussystem J JNeurosci 1985 5 3310 3328 CompanyLogo 5 ConradAM JeanH JoanWB Analysisofthetemporalexpressionofnestininhumanfetalbrainderivedneuronalandglialprogenitorcells J DevelopmentalBrainResearch 2002 134 1 2 87 92 6 VanDcGraaff KentM Humatnanatomy UnitedStatesofAmerica TheMcGrawHillCompanies 1998 340 345 7 SulyoklE VajdaZ Docz