分子生物学实验.ppt

分子生物学实验中南民族大学生命科学学院实验教学中心2006年3月 实验一植物基因组DNA的提取 实验二多聚酶链式反应 polymerasechainreaction PCR 基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测 实验三植物总RNA的提取 实验四蛋白质印迹 高等动物 高等植物的基因组相当宠大 如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成 果蝇基因组有 个碱基对 水稻基因组有 个碱基对 真核细胞基因组中 约 万 万个可表达的结构基因 其它大量存在的是调控序列和内含子序列 可以说某特定物种的基因组 包含了该物种生长 发育 繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量 因而对真核细胞基因组的结构 组成 以及表达调控的研究是至关重要的 而研究的起点就是要获得纯度高 不含蛋白质 糖类 酚 氯仿等污染 得率好 以便有足够量用于分析 基因组相对完整 断裂的基因组以便用于以后 分析 RFLP分析 基因文库的构建 基因探测等的研究 实验一植物基因组DNA的提取 一 实验目的及背景 真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步 首先是机械法破细胞抽提 然后去除蛋白质 糖类等细胞内杂质污染 最后纯化出 由于真核细胞基因组较大 在操作中应注意动作轻柔 且在低温下进行 以最大限度地减少机械和化学作用对 的剪切 从而获得相对完整的 十二烷基肌酸钠 sarkosyl 十六烷基三甲基溴化铵 hexadyltrimethylammomumbromide 简称为CTAB 十二烷基硫酸钠 sodiumdodecylsulfate 简称SDS 等离子型表面活性剂 能溶解细胞膜和核膜蛋白 使核蛋白解聚 从而使DNA得以游离出来 再加入苯酚和氯仿等有机溶剂 能使蛋白质变性 并使抽提液分相 因核酸 DNA RNA 水溶性很强 经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质 上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀 沉淀DNA溶于TE溶液中 即得植物总DNA溶液 三 实验材料水稻幼叶 四 主要试剂配方 2 CTAB抽提缓冲溶液 CTAB4g NaCl16 364g 1MTris HCl20ml PH8 0 0 5MEDTA8ml 先用70mlddH2O溶解 再定容至200ml灭菌 冷却后0 2 1 2 巯基乙醇 400ul 氯仿 异戊醇 24 1 先加96ml氯仿 再加4ml异戊醇 摇匀即可 五 实验步骤1 DNA的提取 1 2 CTAB抽提缓冲液在65 水浴中预热 2 取少量叶片 约1g 置于研钵中 用液氮磨至粉状 3 加入700ul的2 CTAB抽提缓冲液 轻轻搅动 4 将磨碎液分倒入1 5ml的灭菌离心管中 磨碎液的高度约占管的三分之二 5 置于65 的水浴槽或恒温箱中 每隔10min轻轻摇动 40min后取出 6 冷却2min后 加入氯仿 异戊醇 24 1 至满管 剧烈振荡2 3min 使两者混合均匀 7 放入离心机中10000rpm离心10min 与此同时 将600 l的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中 8 10000rpm离心1min后 移液器轻轻地吸取上清夜 转入含有异丙醇的离心管内 将离心管慢慢上下摇动30sec 使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物 10 60sec后 直立离心管 加入720 l的75 乙醇及80 l5M的醋酸钠 轻轻转动 用手指弹管尖 使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中 9 10000rpm离心1min后 立即倒掉液体 注意勿将白色DNA沉淀倒出 将离心管倒立于铺开的纸巾上 11 放置30min 使DNA块状物的不纯物溶解 12 10000rpm离心1min后 倒掉液体 再加入800 l75 的乙醇 将DNA再洗30min 13 10000rpm离心30sec后 立即倒掉液体 将离心管倒立于铺开的纸巾上 数分钟后 直立离心管 干燥DNA 自然风干或用风筒吹干 14 加入50 l0 5 TE 含RNase 缓冲液 使DNA溶解 置于37 恒温箱约15h 使RNA消解 15 置于 20 保存 备用 2 DNA质量检测琼脂糖电泳检测 12345 HindIII 总DNA 六 注意事项 1 叶片磨得越细越好 2 移液器的使用 3 由于植物细胞中含有大量的DNA酶 因此 除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外 第一步的操作应迅速 以免组织解冻 导致细胞裂解 释放出DNA酶 使DNA降解 1 本实验中所用到的各试剂的作用是什么 CTAB 氯仿 异丙醇 75 乙醇 EDTA 2 提取基因组DNA的方法有哪些 各有何优缺点 七 问题 一 实验目的及背景 多聚酶链式反应 polymerasechainreaction 简称 技术 是 年代中期发展起来的一种体外扩增特异 片段的技术 此法操作简便 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的 序列的拷贝 技术虽然问世仅数年时间 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域 引起了生物技术发展的一次革命 目前它在分子克隆 目的基础检测 遗传病的基因诊断 法医学 考古学等方面得到了广泛的应用 实验二PCR实验技术 技术实际上是在模板 引物和 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 聚合酶的酶促合反应 技术的特异性取决于引物和模板 结合的特异性 反应分三步 变性 denaturation 退火 annealing 延伸 extension 反应过程见下图 模板 在 条件下变性形成单链 在 条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合 下在耐热性 聚合酶Taq酶催化下 在 种dNTP存在条件下延伸形成双链 完成一次循环 接着又以新合成的 为模板进行同样反应 如次往复循环 次 由于每次循环目标 都以 n次幂扩增 次循环后目的DNA的量增加 倍 成功的 反应要求反应有很好的特异性 和相当的扩增效率 要达此目的 反应要注意以下问题 二 PCR反应及步骤 模板 反应中 量在 ng ng左右 且 纯度较高 以增加反应特异性 dNTP 反应体系中达100 M 200 M Mg2 Mg2 是Taq酶的辅基浓度在2 0mM左右 浓度太低Taq酶活力降低 太高反应特异性降低 引物 根据目的基因两侧特定序列设计 引物约20碱基左右 含量在40 70 之间 引物内部不能有回该序列 引物 端不能互补 Taq酶 它是从嗜热杆菌中提取的耐热性 聚合酶 在 时 分钟还有 活力 变性温度 在 之间使模板充分变性 复性温度 左右 此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定 它是反应特异性的决定因素 延伸温度 左右 为Taq酶最适反应温度 buffer 500mMKCl100mMTris HCl pH9 0 0 1 明胶1 TritonX 100MgCl22 5mM dNTP 1mM引物 TGGCCGAGCTG5 0uM模板 20ng lTaq酶 5u lPCR仪 凝胶成像系统 电泳系统 向无菌的500 lEppendorf管中依次加入以下溶液 反应物体积10 buffer2 5 l4 dNTP 1mM 2 5 lMgCl2 25mM 2 5 l无菌水10 5 lTaq酶 1U ul 1 l引物2 l模板 20ng 4 l总体积25 l 2 反应体系混匀 离心3 在 仪上按以下方式循环94 变性 分钟36 退火 分钟72 延伸 分钟经过40个循环4 72 延伸反应7分钟 5 取20 l反应液加4 lLoadingbuffer在6 1 5 琼脂糖凝胶上120伏 电泳2小时 7 在凝胶成像系统上观察记录实验结 三 PCR电泳检测 记录实验结果 并估测 扩增产物分子量 四 问题与讨论 简述 基本原理 进行一次成功的 反应顺注意哪些问题 一 实验目的通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法 二 实验原理RNA是一类极易降解的分子 要得到完整的RNA 必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解 高浓度强变性剂异硫氰酸胍 可溶解蛋白质 破坏细胞结构 使核蛋白与核酸分离 失活RNA酶 所以RNA从细胞中释放出来时不被降解 细胞裂解后 除了RNA 还有DNA 蛋白质和细胞碎片 通过酚 氯仿等有机溶剂处理得到纯化 均一的总RNA 实验三RNA提取 三 仪器 药品与试剂配方 一 仪器1 低温离心机2 分光光度计3 琼脂糖胶电泳系统 用前先用1 NaOH溶液浸泡过夜 之后再用DEPC水浸泡冲洗 4 高压灭菌锅5 研钵 剪刀 一次性手套等 一 目的和内容目的 掌握SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 掌握蛋白质印迹技术的基本原理和方法 内容 本实验采用鸡卵清白蛋白为材料 对此蛋白质进行SDS PAGE电泳后 用电转移法将蛋白质转移到硝酸纤维素薄膜上 将预先制备好的鸡蛋清免疫而成的抗血清 作为初级抗体 用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔为第二抗体 在底物存在下 通过显色电泳条带 测定蛋白质性质 实验四蛋白质印迹技术 Westernblotting 二 主要仪器 材料和试剂1 仪器和材料蛋白质电泳槽 蛋白质电转移槽一套 六一仪器厂 硝酸纤维素滤膜 黄岩化工厂 直径为20cm及10cm玻璃平皿各一个 剪刀 镊子 刀片 一次性手套 普通滤纸 鸡卵清白蛋白 鸡卵清免疫兔的抗血清 辣根过氧化酶 羊抗兔抗体 1 500稀释 四氯奈酚或者二氨基联苯胺 过氧化氢 2 试剂 1 TBS要Tris HClNaCl缓冲液 20mml LTris HCl 500mmol LNaCl PH 7 5 2 TBS要Tris HClNaCl Tween 20缓冲液 20mmol LTris HCl 500mmol LNaCl 0 05 Tween 20 PH 7 5 3 抗体溶液 牛血清白蛋白质 TBS溶液 1 BSA TBS 4 Blocking溶液 封闭液 10 牛血清 TBS 5 底物溶液 0 5mg mL 25mg四氯奈酚 加5mL甲醇溶解后 加10ml在30 水浴中温浴的TBS溶液 混合后再加50mlTBS 然后再加入10 l30 过氧化氢立即使用 6 转移缓冲液 25mmol LTris 192mmol LGlycine20 MethnolL pH8 3 7 去离子双蒸水 1 焦碳酸二乙酯 DEPC 2 吗啉代丙烷磺酸 MOPS 3 异硫氰酸胍4 醋酸钠 NaAc 5 氯仿6 苯酚7 甲醛8 乙醇9 乙二胺四乙酸 EDTA 10 琼脂糖11 异丙醇 三 试剂配方1 0 1 DEPC水0 1mlDEPC加入100ml三蒸水中 振摇过夜 再湿热灭菌 2 2mol LNaAc 0 5mol LEDTA 4mol L异硫氰酸胍 4mol LLiCl等均用DEPC水配制 3 5 MOPS电泳缓冲液 pH7 0 MOPS0 1mol LNaAc40mmol LEDTA5mmol L 四 实验步骤 一 总RNA的提取 方案一 1 实验前10天左右播种水稻种子 在3 4叶期 剪取1 2g幼叶 放入研钵 在液氮中研磨成粉末状 移入10mL离心管 加入4mol L异硫氰酸胍4mL苯酚3mL2mol LNaAc pH4 8 0 3mL氯仿0 6mL混匀 冰浴放置30min 2 4 8000r min 离心13min 3 弃沉淀 取上清至另一干净无菌离心管中 4 加入2倍体积无水乙醇 70 0 5h 5 4 8000r min 离心13min 三 操作操作步骤1 制备兔抗鸡蛋清白蛋白血清将鸡蛋清与生理盐水1 1混匀后 与石蜡有完全佐剂和不完全佐剂研磨而成抗原 选择两只家兔 皮下多点注射3次 每周一次 加强一次 每次四个点 每点0 2ml抗原 5周后颈动脉放血 取血清作为WesternBlotting的第一抗体 6 弃上清 在沉淀中加入1mL4mol LLiCl 使其溶解 7 移入1 5mL离心管中 冰浴2h 8 4 13000r min 离心15min 9 弃上清 在沉淀中加入400uLDEPC水 再加入400uL氯仿 混匀 10 4 13000r min 离心6min 11 取上清 并加入1 10体积3mol LNaAc pH5 0 2倍体积无水乙醇 20 放置30min 12 4 13000r min 离心20min 13 将沉淀RNA用70 乙醇洗涤2次 14 将沉淀RNA室温下稍干燥 15 加30uLDEPC水溶解 70 保存 混合液轻轻混匀并离心 放于65 下温育5min后 置于冰上 1 1 配制1 2 变性琼脂糖凝胶 40mL 2 称取0 48g 加入DEPC水25 2mL 5X电泳缓冲液4mL 加热使溶解 稍冷却加入甲醛3 4mL 混匀 室温凝固0 5 1h RNA电泳检测 3 电泳检测将1 2 变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中 加1