实验三 酵母核糖核酸的提取及测定.doc

实验三 酵母核糖核酸的提取及测定预习报告1、 研究背景 生物大分子物质通常是指动物植物微生物进行新陈代谢时所产生的蛋白质和核酸等有机化合物。它不仅是生物科学工作者研究者的重要对象，且与化学、医学和食品等工业部门有密切关系。在科研和医学方面，探讨结构与功能、防治某些疾病时常需要较纯的生物大分子物质。然而这类物质往往与自然界存在的各种不同的化合物结合在一起或自身之间相互结合在一起，离体后稳定性较差，含量偏低，且提取的材料复杂，因此纯化的方法也很多。微生物是工业上大量生产核酸的原料，其中酵母最为理想。本次实验以干酵母粉为实验材料，提取RNA，并测定其含量。2、 研究目标 掌握核酸分离纯化的基本设计思想及主要操作细节和生物制品开发的基本思路。3、 研究策略酵母细胞中RNA通常与蛋白质结合。要提取RNA就要破细胞壁，让它释放出来。浓盐法通过改变细胞膜的通透性释放出胞内物质，然后沸水浴使RNA水解酶失活。再通过调节pH将RNA充分沉淀，洗涤，干燥，测量。4、 研究方案及可行性分析浓盐法是在加热条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来。提取RNA时需注意掌握温度，直接在90100浸提，避免在2070之间的时间过长，磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使RNA因降解而降低提取率。洗涤沉淀时要反复抽提，离心以纯化RNA。测定提取的核酸含量，只需测定组成核苷酸的任意一种组分即可。碱基在260nm有光吸收，采用紫外吸收法可测定核酸含量。5、 具体实验设计1、 所需主要材料：食品用干酵母粉；试剂：10%NaCl, 6MHCl , 95%乙醇，2%氨水，RNA沉淀剂（0.5g钼酸铵+193ml水+7ml70%过氯酸）；仪器设备：烘箱，离心机，天平，紫外分光光度计，移液器，恒温水浴锅，玻璃匀浆器，pH计。主要器皿：研钵，离心管，容量瓶25ml 50ml；具塞试管；三角瓶；小烧杯。2、 具体操作步骤1.提取：称取7g酵母粉，于研钵中小心研磨成面粉状粉末，转移至三角瓶。量取50mlNaCl,倒入三角瓶，使酵母粉完全彻底悬浮浸润。（用高浓度盐溶液改变细胞膜的通透性释放胞内物质）小心置于沸水浴，浸提40min。（使RNA水解酶失活）1. 分离：取出上述提取液，冰浴冷却10min。（防治酶复性）转入离心管30min，3500r/min, 提取上清液。2. 沉淀RNA：倾倒上清液于小烧杯中，冰浴冷却至10以下后，（不拿出去）用6M HCl在搅拌下调节pH至2.02.5（等电点时RNA溶解度最小，沉淀量最大。）。调节好后继续于冰浴中放置4h使沉淀颗粒变大。3. 洗涤纯化：将冰浴后的悬浮液轻柔彻底地充分搅拌，转入离心管，3500r/min离心15min。弃上清液，在离心管中用95%乙醇洗涤沉淀三次，每次用约15ml乙醇充分彻底悬浮搅拌洗涤，3000r/min离心10min。4. 干燥：最后一次洗涤RNA沉淀后，立即将预先在80烘箱内干燥的硫酸纸取出，精确称重后折成框（半厘米高）。用药勺将RNA沉淀从离心管内转出，均匀涂布于硫酸纸上。置于80烘箱内5min.(使沉淀充分干燥，避免称重误差)干燥后的硫酸纸与沉淀一起称重。将大部分RNA制品小心转移至玻璃匀浆器，记录剩余制品和硫酸纸总重量。5. 紫外法含量测定：1)提取的RNA小心转入玻璃匀浆器后，加入5ml蒸馏水，沉稳垂直地匀浆至均一的胶体溶液。转移至洁净小烧杯。用10ml左右的蒸馏水分次清洗匀浆器一并转入烧杯。（注意烧杯刻度不能超过15ml）混匀烧杯内RNA溶液，用2%氨水调节pH7.0。转入25ml容量瓶，蒸馏水分次清洗一并转入。 定容，混匀。 2)取两支试管按下表配制：管号RNA溶液H2O沉淀剂A5ml5ml-B5ml-5ml3） 各自混匀，冰浴20min. 转移入离心管，3500r/min离心10min。取上清液于另两支试管，分别混匀。 各取0.5ml于两个50ml容量瓶，蒸馏水定容。 紫外分光光度计下测定OD260。3、 预期原始数据记录1） RNA的提取硫酸纸质量m0 _; 干燥后硫酸纸与沉淀总质量m1 _; 转移后剩余制品与硫酸纸总质量m2 _;RNA总制品质量= m1 m0 =_;定量样品质量= m1 m2 =_;RNA 制品纯度=_; 产率=_。2） 紫外法测RNA含量管号ABOD2606、 质疑及相关思考1、 作为商品开发，我们更多的是应该考虑市场需求的共性还是个性？为什么？相应的，如何完成相关欲开发产品的定位？答： 我们应更多地考虑市场需求的个性。随着社会的发展，市场由卖方市场转变为买方市场，商品丰富，货源充沛，消费者有了挑选商品的余地，而卖方之间在质量、价格、促销等方面展开竞争。在竞争激烈的市场中，若能有优于其他产品的特性并成功定位，给自己贴上合理的标签，就能够抓住消费者的心，否则就只能在莫大的市场淹没。 产品的定位应追求差异化，比如生物制剂的开发，从质量上比其它制剂纯度更高，价格相对便宜等，都是合理的产品定位。2、 基于生物制品的产业开发，探讨实验室的科学研究和大学工业生产之间的关系和异同之处？答：实验室是一个较小的环境，大都可以在比较好的条件下进行实验，而在应用到工业生产的大环境中时可能会遇到更多细节方面的问题，比如仪器设备的精度等。工业生产选择方案要尽量低成本，而少量物品的