课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

专题二微生物的培养与应用 课题二土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 上一节课我们已经学习了培养基的配制以及接种技术 现在我们就来学习如何从土壤中将我们需要的微生物进行分离 导入新课 尿素是一种重要的农业氮肥 分子式为H2NCONH2 不能直接被农作物吸收 土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用 原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 你能想一想怎样能将分解尿素的细菌从土壤中分离出来吗 想一想 一 筛选菌株 温泉 冰川 研究思路 分解石油的细菌 油田 筛选原则 根据微生物对生存环境的要求 到相应的环境中去寻找 实例 TaqDNA聚合酶的发现 DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术 此项技术的自动化 要求使用耐高温的DNA聚合酶 该去哪里寻找 科学家是从水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶的 美国黄石国家公园的一个热泉 选择培养基 定义 允许特定种类的微生物生长 同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基 叫做选择培养基 选择培养基配方 在图中的培养基配方中 碳源和氮源分别是什么 碳源 葡萄糖 尿素 氮源 尿素 1 显微镜直接计数 利用血球计数板 在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量 不能区分死菌与活菌 个体小的细菌在显微镜下难以观察 缺点 二 统计菌落的数目 2 稀释涂布平板法 活菌计数法 原理 当样品的稀释度足够高时 培养基表面生长的一个菌落 来源于样品稀释液中的一个活菌 恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键 样品稀释培养示意图 选30 300个菌落的平板统计 每个稀释度取3个平板取其平均值 统计的菌落往往比活菌的实际数目低 计算公式 每克样品中的菌落数 C V MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积 ml M代表稀释倍数 是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响 提高实验结果的可信度 三 设置对照 1 设置对照的目的 2 对照实验 指除了被测试的条件外 其他条件都相同的实验 实验组 对照组 设置对照 同等条件下 培养空白培养基 实例 在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时 A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落 但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落 分析其原因 原因 1 土样不同 2 培养基污染或操作失误 或者是混入了其他的含氮物质 小结 通过这个事例可以看出 实验结果要有说服力 对照的设置是必不可少的 方案一 由其他同学用与A同学相同土样进行实验 方案二 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养 作为空白对照 以证明培养基是否受到污染 结果预测 如果结果与A同学一致 则证明A无误 如果结果不同 则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题 实验设计 一 土壤取样从富含有机物 潮湿 酸碱度适中的土壤中取样 铲去表层土3cm左右 取样 将样品装入事先准备好的信封中 微生物的天然培养基 数量最大 种类最多 大约70 90 是细菌 制备选择培养基 尿素为唯一氮源 制备牛肉膏蛋白胨培养基 对照作用 思考 为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基 制备培养基 二 样品的稀释 分离不同的微生物采用不同的稀释度原因 不同微生物在土壤中含量不同目的 保证获得菌落数在30 300之间 适于计数的平板 1 测细菌数 一般用104 105 106稀释液 2 测放线菌 一般用103 104 105稀释液 3 测真菌数 一般用102 103 104稀释液 按浓度捆成一摞 恒温37 培养 三 微生物的培养与观察 培养不同微生物往往需要不同培养温度 细菌 30 37 培养1 2d放线菌 25 28 培养5 7d霉菌 25 28 的温度下培养3 4d 1 在菌落计数时 每隔24h统计一次菌落数目 选取菌落数目稳定时的记录作为结果 这样以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目 2 以 稳定菌落 为观察对象 原因 不同种类的细菌形成的菌落 在大小 形状 光泽度 颜色 硬度 透明度等方面具有一度的特征 菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据 观察 不同形态的菌落 不同形态的菌落 一 培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长 说明培养基没有被杂菌污染 牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目 说明选择培养基已筛选出一些菌落 结果分析与评价 二 样品的稀释操作是否成功如果得到了2个或2个以上菌落数目在30 300的平板 则说明稀释操作比较成功 并能够进行菌落的计数 三 重复组的结果是否一致如果学生选取的是同一种土样 统计的结果应该接近 如果结果相差太远 教师需要引导学生一起分析产生差异的原因 操作提示 无菌操作 做好标记 规划时间 课题延伸 pH升高指示剂 酚红 将变红 研究思路 实验设计 筛选菌株 选择培养 筛选原则 统计菌落数目 操作提示 无菌操作 做好标记 选择培养基 定义 配方 目的 定义 土壤取样 配制培养基 制定计划 结果分析与评价 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 设置对照 微生物培养与观察 细菌的计数 课堂小结 1 能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是 A CO2和N2B 葡萄糖和NH3C CO2和尿素D 葡萄糖和尿素 D 随堂练习 2 可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是 A 以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂B 以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C 以尿素为