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文档简介

细胞传代培养及细胞计数 人癌细胞系传代培养 1 观察 培养细胞生长活跃 占瓶底80 90 无污染 2 弃废液 倒掉瓶中培养液 尽量沥干液体 3 漂洗 加1ml0 25 胰蛋白酶消化液漂洗1次 弃去消化液 4 消化 再加1ml消化液漂洗1次 倒掉大部分消化液 保留约0 3ml 室温放置3 5min 5 吹打 镜下看到细胞收缩变园 加1 2ml含血清培养液 用吸管按顺序轻轻吹打 避免出现泡沫 6 计数 取样 计数 调整细胞浓度 7 接种及培养 按104细胞 ml接种 37 5 CO2 饱和湿度条件下培养 注意事项 细胞生长至覆盖培养瓶底面积80 左右时 开始传代 首次传代培养应适当提高接种细胞浓度 细胞混杂生长时 可根据需要选择合适的方法纯化细胞 血球计数板法 制备细胞悬液 细胞密度 104 ml 细胞过多时需适当稀释 单个细胞率 95 加样 混悬细胞 取少许细胞悬液 从计数池一侧加入 不要溢出或出现气泡 计数 10倍物镜下计数四角大方格内的细胞 压线者只计左边线和上边线 计算 细胞数 ml 四大格细胞总数 4 104 稀释倍数 细胞活力测定 台盼蓝染色法 制备单个细胞悬液 105 106 ml染色 0 04 台盼蓝染色1min 9滴细胞悬液 1滴0 4 台盼蓝 3min内计数计数 用血细胞计数板镜下分别计数活细胞 染料拒染 和死细胞 呈淡蓝色 计算细胞活力 活细胞率 活细胞数 活细胞数 死细胞数 100 细胞密度调整 稀释公式 C1 V1 C2 V2稀释前细胞密度C1 溶液体积V1稀释后细胞密度C2 溶液体积V2 细胞计数 106 mlCellsusspension 105 ml 104 ml 103 ml 0 1ml 0 1ml 0 1ml Medium0 9ml 细胞生长曲线测定 计数法 DT t lg2 lgNt lgNo 培养细胞的纯化方法 机械刮除法 用细胞刮刮出不需要的细胞差速粘附法 成纤维样细胞 上皮样细胞选择性酶消化法 金属管套取需要的细胞密度梯度离心法 细胞漂浮密度 Ficoll Percoll克隆化培养法 琼脂法 有限稀释法免疫磁珠分离法 细胞表面标志 免疫磁珠速度沉降法 细胞大小 离心淘洗技术电泳分离法 细胞表面电荷 细胞培养过程中常见的问题 培养液pH值快速偏离 CO2浓度异常 培养瓶盖过紧 细菌 酵母或霉菌污染培养液出现沉淀 细菌或霉菌污染细胞不贴壁 胰酶过度消化细胞 支原体污染 缺乏附着因子 细胞死亡 孵箱中缺CO2 孵箱温度不稳定 细胞冻融损伤 渗透压改变 培养液中毒性代谢产物堆积细胞生长缓慢 培养液或血清改变 基本促生长成分的消耗
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