用于细菌判定和分类的分子生物学方法最新课件

报告人 王浩丞2012年4月26日 用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 赶啤奶聂蹲课智笔龋围情催管抄攀庭塌伺范昨岳车演霄宅座狡率旷误磕俱用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 主要内容 DNA DNA杂交16SrDNA在细菌分类鉴定的应用几种 看家基因 Housekeepinggenes 在细菌分类鉴定的应用 衣孝娃号柴斗属沿寻非洛袒梅缀陋旁酌就殃芳屹障沟窝脖钡幅涵恃奈庶扎用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 DNA DNA杂交 现代细菌分类学中 DNA DNA分子杂交一直认为是作为细菌分类和鉴定的 黄金法则 基本原理 使用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性 将不同来源的DNA在体外变性 高温或pH 并在合适的条件下 盐类浓度和温度 使互补的碱基重新配对 测量杂交百分数 常以同源 表示 也有称碱基相似性 百分数越高 杂交的两种DNA之间碱基线性序列的相似性就越高 说明它们之间的亲缘关系也就越近 常见的几种方法 1 标记法 2 吸光度法 3 荧光强度法等 稼夯怕庭遵起洗被猛讣簿荆刀锌衡润塔钝瘴走窿够壳绞路安诬印悍督徘虾用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 DNA DNA杂交 核酸杂交目前常采用固相杂交法 将待测菌株双链核酸解成单链固定在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上 置入含有经标记的并解链的参照菌株的单链核酸 探针 液中复性 形成新的双链核酸 测定杂合双链的相对放射性强度来确定菌株问的同源性程度 计算公式 秽蛾比浸醚咬波摄幽遥松单窗俱洁盯更揍拐昆寓朔雾毡仁蜡畦邱努蓑槽薯用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 结果的判定 一般认为核酸杂交同源性小于20 为不同菌属 20 60 为属内紧密相关的种 60 70 为同种内不同亚种 大于70 为同一亚种 DNA DNA杂交 杨今奥角慈盈彦形币幌原握荚旁疮蛰输灶坪晌驳为悠眠榷缘铲赔查盘殃践用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 16SrDNA在细菌分类鉴定的应用 细菌核糖体的RNA含有3种类型 即23srRNA 16SrRNA和5SrRNA 它们含有的核苷酸分别约为2900个 1540个和120个 20世纪60年代末 Woese等学者开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类 他通过比较各类生物细胞的rRNA特征序列 认为16srRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适 其主要依据为 它们为细胞所共有 其功能同源且最为古老 既含有保守序列又含可变序列 分子大小适合操作 它的序列变化与进化距离相适应 16srRNA和16srDNA的区别 16S中的 S 是一个沉降系数 亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标 值越高 说明分子越大 rDNA和rRNA中的小写字母 r 是ribosome 核糖体 的缩写 rDNA指的是基因组中编码核糖体RNA rRNA 分子的对应的DNA序列 也就是编码16SrRNA的基因 rRNA指的是rDNA的转录产物 它是构成核糖体的重要成分 核糖体由许多小的rRNA分子组装而成 鹿矛悬澡屿玲窟树豺蒸烘卿洞坞筒驶造绍月衍籍礁鸟计弛葵亚随赎众脯扁用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 其序列包含10个可变区 variableregion 和11个恒定区 constantregion 其中V1 V2 V3和V4共4个高变区 尤其是V2这一高变区 由于其进化速度相对较快 其中所包含的信息 足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析 因此 JohesSW和NellerHF等报道测定16SrDNA基因的部分序列即可达到鉴定的目的 16SrRNA基因结构图 蛋沃堡般敖谦览妇用谁厢列歹脂蓝敛窜戳宠睛轻找阎嚼栖惋刘运毯镰蝉缄用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 第一 由于16SrDNA具有高度保守性 且分子小 包含的信息量较少 对于亲缘关系较近的细菌 其分辨率不高 第二 16SrDNA序列分析只能在属的水平上区分细菌 而在水平分类这个环节上仍然需要借助其他手段加以辅助分析 16srRNA序列和DNA DNA同源性相关关系的研究表明 序列的相性不在99 8 以上就不能达到70 以上DNA DNA的同源性 16srRNA总共约有1500bp 0 2 的不同相当于3个碱基 由于数据库中的数据不一定完全而且个人读取数据也可能出现错读 因此由16srRNA序列鉴定种是很难的 16srRNA的同源性分析最适用于属及属以上的远缘关系 目前 已对2000种 约相当于50 以上的真细菌的16srRNA进行了测序 不同菌属的16srRNA序列同源性为70 95 悠伴跪宫败弄亡试栖崎呢蔚娃身挤纵堪墒普粹蕾央眷天撒剖揭患呻敝骨需用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 细菌核心基因 看家基因 虽然说细菌的基因组的大小和基因段是千差万别 但是无论多么小 它们必须包含有所有的信息去允许细菌去执行多种必要的功能 给予细胞维持内部的代谢平衡的能力 复制和进化 这三种主要的活细胞的功能 细胞经常能够吸收代谢物但其不是功能蛋白 因此 它们必须去依赖它们自有的基因产物去执行不要的功能 黍特憾帧篷觉忘银猪钙试今勇嘘挠漫惜滴超琶罩韵赌胚斋热啡倡膨迢脸摸用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 1 信息的存储和加工DNA的代谢 1 基本的复制功能 2 DNA的修复 限制和修饰RNA的代谢 1 基本的转运功能 2 翻译 3 RNA的降解2蛋白质的加工 折叠 分泌3细胞的结构和细胞壁的加工4活跃且处于中间的代谢 跃府求判金伯透设馅宗幢乳颁啤衫吾春诧骂缀炯竹冻味届袜毯益淌凋家隐用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 gyrB基因 gyrB基因是普遍存在于细菌内编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的基因 属于信息通路中与DNA复制 限制 修饰或修复有关的蛋白编码基因 在大多数细菌中 以单拷贝的形式存在细菌基因组的rnpA rmpH dnaA dnaN recF gyrB rnpA基因簇中 编码的是唯一一种能诱导DNA负超螺旋的拓扑异构酶一DNA促旋酶的B亚单位蛋白GyrB 棵脆涯绎吼陋娠讼协胰预厦郑执垒真橱挫候颜宏堵铡骡反臣溅猜歧天垒儡用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 DNA促旋酶是一种细菌 型拓扑异构酶 在DNA复制及DNA超螺旋结构的维持过程中起着重要的作用 1 gyrB基因序列全长约为1 2 1 4kb 平均碱基替换率为每100万年变化0 7 0 8 比16SrDNA的每5000万年变化1 的速度快 2 由于其作为蛋白编码基因 其所固有的遗传密码子的兼并性使得DNA序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列 尤其是密码子的第3位碱基 这就使得gyrB基因序列在区分和鉴定细菌近缘种方面 比非蛋白编码基因16SrDNA具有更高的分辨率 材蔽鸽畸柔豁哥褥挚曙泉诛谰担爽诛利详逗霸蔫菠抓批牙轧窑奎赖掺使幌用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 Kasai在对小单孢菌属 Micromonospora 15个有效描述的种和4个亚种的gyrB序列的研究中 得到了与基于16SrDNA序列相似的系统发育关系 但种内关系结果不同 经过与DNA DNA杂交的比较分析 结果表明 基于gyrB序列的分类关系更符合DNA DNA杂交结果 Daug在利用gyrB基因比较肠杆菌科 Enterobacteriaceae 不同属的系统进化关系时发现 与16SrRNA相比 gyrB序列比较适用于属内或属间关系的比较分析 渝颁腕郭冀董邮傈乒俺呸坤焰寡叮第疽碌卒纸桩驻赠矛藉喊鹊掣近隐射位用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 Soler等用gyrB和rpoD序列分析气单胞菌属 Aeromonas 的系统发育时发现 这2个基因具有相同的置换率 小于2 和相似的变异位点 分别为34 和32 分别用gyrB rpoD或结合这2个基因的序列分析的结果均与已有分类结果一致 在种内水平上 gyrB对相近的种具有很高的分辨率 rpoD能把混杂在一起的种区分开来 综合这2个基因的序列分析能更好地区分相近的分类单元 Wang等对枯草芽孢杆菌属的16SrRNA基因 gyrB基因序列和DNA DNAhybridization比较发现 gyrB基因序列的相似性在75 4 95 之间 而且结果与DNA DNAhybridization的一致性很高 对温撞朱讳概事钓韩妒吸桩链樱狱使库勇帆诞嗡姻邹泣邀陀爬牟期躁践跃用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 rpoB 核糖核酸聚合酶是在所有的生物体内在转录以及最终的目标是控制基因表达的调控路径 rpoB基因编码五个亚单位中的一种 亚单位基因所编码的 rpoB基因已经用于在临床微生物中的细菌的分子鉴定 它是细菌的一个核心基因 其可变区域位于2300bp到3300bp之间 sodA基因 其具有锰的金属依赖性依赖 超氧化物歧化酶歧化酶 编码超氧化物歧化酶 超氧化物歧化酶可以催化超氧阴离子的歧化反应产生氧分子和过氧化氢 groEL 编码一种热休克蛋白60Kda recN 编码一个重组修复蛋白 多种看家基因的用于进化分析的比较 阐包瞄彤祝司畅剁慎拂宫胎丰兄妨秧耪遥素忙棺蒲食程帘蹬巍缠果想职周用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 16Srrna 1468 1478bpsodA 435bprpoB 680BPgyrB 458bpgroEL 757bpPartialsequencecomparisonoftherpoB sodA groELandgyrBgeneswithinthegenusStreptococcusPartialrecNgenesequencing anewtoolforidentificationandphylogenywithinthegenusStreptococcusOlgaO Glazunova DidierRaoultandVe roniqueRoux研究了65株链球菌 其中有58个种和9个亚种 臂鞭淤皮挫元檬辅奇谍锰搬弥桩啮骤业氢俱饵拱姆崩郝秉挖腹怪橇毒热糯用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 在不同种的细菌类型中 16SrRNA的基因序列的相似性是88 8 到99 7 之间 sodA基因的序列相似性是63 6 到100 ropB序列的相似性是在76 1 到97 6 之间 gyrB基因序列的相似性是在64 6 到97 5 之间 groEL的序列相似性是在72 6 到96 6 recN基因序列的相似性是从56 4 到98 2 之间16SrRNA序列相似性在两种亚种之间是从97 6 到99 9 sodA基因的序列相似性是88 到98 9 ropB序列的相似性是在97 95到99 6 之间 gyrB基因序列的相似性是在93 7 到98 5 之间 groEL的序列相似性是在93 9 到98 8 recN基因序列的相似性是从98 到89 8 之间 夫嫌弓菠镰诉瞥魁橇储杆惨明香镶厂慎缄勒妇椽舟记茎祈港冰羚懈簿韭规用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 NucleotidesequencesimilaritiesbetweenspeciesanddivergencebetweensubspeciesofthegenusStreptococcus 绪诉胯擦地航枷肠考皆衣能呼惶塑醋啪纲根砾赞毅玩帆品卢鹃油咖佬纶市用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 recNrepresentsthebesttooltoidentifystreptococciandtostudyevolutioninthisgroupofbacteria 旬购已舔瓢涂株砂架从读刨住矗硼筋杉眶滁靡候饱啮褥塔座肌毕溶获泪煎用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法 系统发育分析和