制药092第二组.ppt

西瓜细胞核雄性不育系雄花蕾的mRNA差异表达分析 生物技术093第二小组 摘要 为阐明西瓜G17AB系雄性不育发生的分子机制 采用mRNA差异显示技术 分析了不育株与可育株雄花蕾发育过程中基因表达的差异 经重复验证 获得了2个稳定表达的差异cDNA片段 C13F和G10S 经克隆测序和同源性分析 C13F片段与拟南芥 葡萄糖苷酶酶蛋白的部分编码序列具有80 同源性 G10S片断与菜豆泛素mRNA的编码序列具有92 同源性 关键词 西瓜 细胞核雄性不育 mRNA差异显示 前言 植物花粉发育的分子生物学 已经成为植物分子生物学研究中的热点领域 在花粉的发育过程中 涉及近万种特异基因的表达 但目前已鉴定的花粉发育特异基因不过几十种 1 因此 研究花药 花粉在发育过程中基因表达的时空特异性 分离相关特异基因和特异启动子 对于认识植物花粉发育的分子机理具有重要意义 Liang等 2 在1992年首先建立的mRNA差异显示技术 为研究基因表达调控提供了一种简便有效的方法 这种方法克服了以往鉴别基因差异表达方法如减法杂交和差异杂交等存在的实验周期长 操作复杂 效率低 费用高等缺点 被各国学者广泛采用并不断改进 应用于与生物发育密切相关的许多领域 1988年 夏锡桐等 3 在龙蜜100号西瓜自交后代中发现了雄性不育株并选育G17AB雄性不育两用系 此后有关西瓜雄性不育材料的发现及研究报道较多 主要集中在细胞形态 生理生化和分子标记等方面 4 6 而有关不育和可育基因表达差异的研究罕见报道 西瓜G17AB细胞核雄性不育两用系经过多代系内自交 不育株与可育株具有相同的遗传背景 两者仅雄花表现不同育性 是研究育性基因时空表达的理想材料 本实验室在对西瓜G17AB细胞核雄性不育两用系的细胞形态 生理生化和分子标记研究的基础上 采用mRNA差异显示技术 对西瓜G17AB细胞核雄性不育两用系的可育株与不育株雄花蕾发育过程中的基因表达差异进行研究 以期阐明西瓜细胞核雄性不育发生的分子机理 1 材料和方法 1 1材料春季将西瓜G17AB细胞核雄性不育两用系定植于日光温室内 雄花开放时鉴别可育株和不育株并挂牌编号 选取不育株和可育株各10株 摘取全部雄花蕾及开放当天的雄花后按不育和可育混合 采集的样品经液氮处理后立即置于 70 冰箱中保存备用 1 2试剂TakaraRNAPCRKit AMV Ver2 1 DNase T4RNA连接酶 dNTPs TaqDNA聚合酶 DNA分子量Marker均购自Takara公司 其余试剂为国产分析纯 1 3引物表1 表2中的3条锚定引物和26条随机引物由上海博亚生物技术有限公司合成 1 4西瓜G17AB系雄花蕾总RNA的提取及纯化采用Trizol试剂提取西瓜雄花蕾的RNA DNase RNase free 5U L 1 降解总RNA基因组DNA 用2 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性 岛津UV 2201型紫外分光光度计定量纯化的RNA浓度 并调整至1g L 1 1 5反转录PCR RT PCR 采用RNAPCRKit AMV Ver 2 1 TaKaRa 进行反转录 反应体系及操作步骤按照说明书要求进行 反转录结束后取1 LcDNA进行常规PCR反应 反应体积20 L 反应程序为 94 2min 94 30s 40 45s 72 20min 30个循环 72 延伸5min 4 保存 PCR扩增产物在6 变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离 电泳后银染拍照 1 6差异cDNA条带的克隆 测序及序列分析将差异片段从PAGE凝胶上挖出 放入0 2mL离心管中 加纯水30 L 96 或煮沸10min 取其中4 L为模板 于25 L扩增体系重新扩增 利用DNA凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收扩增片段 与pMD18 T载体连接 然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞 通过蓝白斑筛选和PCR鉴定阳性克隆 测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成 序列进入NCBI数据库进行BLAST分析 2 结果与分析 采用Trizol试剂成功地从西瓜G17AB雄性不育两用系雄花蕾中分离出总RNA 2 0 琼脂糖凝胶电泳检测结果表明 28S 18S和5SRNA谱带清晰完整 图1 A 但含有基因组DNA 经DNA酶消化 28S 18S和5S的RNA条带清晰 基因组DNA谱带消失 图1 B 紫外分光光度计检测D260nm D280nm比值介于1 8 2 0 D260nm D230nm的比值均大于2 0 表3 表明 利用Trizol试剂提取西瓜G17AB雄性不育两用系雄花蕾总RNA经DNA酶消化后符合RTPCR的分析要求 2 1西瓜G17AB雄性不育两用系雄花蕾总RNA的提取 本试验选用了AAGCT10G AAGCT10A AAGCT10C3条锚定引物与26条随机引物组合成78对引物组合 对可育株与不育株雄花蕾的cDNA进行差异显示分析 结果显示 所有引物组合均能扩增出条带 但不同引物组合扩增的cDNA条带数目不等 多者可达50余条 少的仅10多条 一般在30条左右 2 2不育株和可育株雄花蕾RT PCR的结果 大多数引物组合的不育株与可育株雄花蕾RT PCR扩增谱带完全一致 只有少数引物组合显示谱带的差异 图2 这表明混合取样可消除因不育和可育雄花蕾发育时期的不同而造成的影响 使谱带之间的差异表现为育性差异 在78对引物组合中 不育株雄花蕾与可育株雄花蕾的DDRT PCR扩增产物完全相同的为73对组合 表现差异的组合共5对 其中3对是可育较不育多一条特异条带 2对是不育较可育多一条特异条带 经重复验证 仅有2对引物组合的差异性条带表现稳定可重复 命名为C13F和G10S 图3 C13F表示dC锚定引物和编号13的随机引物组合 差异条带出现在可育雄花蕾上 G10S表示dG锚定引物和编号10的随机引物组合 差异条带出现在不育雄花蕾上 2 3差异cDNA片断的克隆测序及序列分析 差异cDNA片断从变性聚丙烯酰胺凝胶上回收后 重新经PCR扩增 2 琼脂糖凝胶电泳 从琼脂糖凝胶上回收cDNA片断 纯化后直接与pMD18 TVector TaKaRa 连接 转化感受态EcoilJM109 经蓝白斑筛选 挑取白斑单菌落培养 煮沸法回收质粒 PCR鉴定后测序 2个差异片断的序列见图4 对获得的cDNA片断序列经国际互联网GeneBankBLAST序列分析 C13F片断与拟南芥 葡萄糖苷酶酶蛋白的编码序列具有80 同源性 G10S片断与菜豆泛素mRNA部分编码序列具有92 同源性 3 讨论 mRNA差异显示技术是一种快速高效的研究基因差异性表达的方法 已在生物技术相关领域中广泛应用 mRNA差异显示技术具有假阳性高的缺陷 要求研究的2个材料除要显示差异外必须具备相同遗传背景 这样才能保证所到的结果具有分析价值 本研究所选用的西瓜细胞核雄性不育材料由自然突变造成 属等位基因突变 且经过多代系内自交 不育株和可育株除育性基因外具有相同的遗传背景 考虑到可育株与不育个体之间的遗传组成可能存在一定的差异 且相同大小的雄花蕾在发育时期上可能存在着不一致 本试验采用混合取样法 试验结果表明 采用混合取样法 大多数引物组合的不育与可育雄花蕾的差异显示电泳图谱完全一致 基本上消除了由于遗传景和发育时期不同造成的过多假阳性条带的出现 有关特异cDNA片断与雄性不育关系的研究已有一些报道 7 10 并克隆了一些与雄性不育相关的cDNA片段 本研究克隆了2个与雄性不育发生相关的cDNA差异片断 其中一个是在可育雄花蕾中表达而在不育雄花蕾中不表达的cDNA片断 该片断与 葡萄糖苷酶酶蛋白的部分编码序列具80 的同源性 葡萄糖苷酶 EC3 2 1 21 属于水解酶 其功能是将纤维素二糖纤维素寡糖水解成葡萄糖 11 由此可以推测 不育雄花蕾中 葡萄糖苷酶酶蛋白不表达 可能导致孢子发育过程中营养物质不足 最终导致小孢子败育 另一个仅在不育雄花蕾中特异表达的cDNA片断与菜豆泛素mRNA的部分编码序列具有92 同源性 泛素的主要功能是参与细胞内短周期寿命的蛋白质降解 12 可以推测不育雄花蕾中泛素基因的表达 可能造成蛋白质降解而使细胞提前凋亡 最终导致雄性不育 目前分离所得的与雄性不育相关的基因还不多 材料主要集中在拟南芥突变体上 mRNA差异显示技术分析西瓜G17AB两用系雄花蕾基因的差异表达结果显示 不育雄花蕾可育雄花蕾都具有特异的cDNA条带 表明不育雄花蕾和可育雄花蕾都产生不同的mRNA 由此可以推测 育性基因可能为调节基因类型 其表达与否能调控着某些基因的表达 于远等 10 应用mRNA差异显示技术 研究西瓜核雄性不育材料Se18不育株和可育株雄花花蕾中基因表达的差异 获得了3个与不育相关的特异cDNA片段 本研究与此研究结果的不同可能是由于试验材料 取样方法和选的引物组合不同而造成的 由于mRNA差异显示技术存在假阳性高的缺陷 这些片段的可靠性还有于进一步Northern验证 其结构和功能均有待于进一步深入研究 本研