生物化学第三章核酸化学 课件

第三章核酸化学 NucleicAcidchemistry 1 核酸的化学组成结构及其性质2 核酸的测定方法3 核酸的研究技术 重点 1 RNA DNA一级结构的测定原理与方法2 双螺旋结构要点 三叶草结构要点3 核酸研究的常用技术及应用4 核酸含量的测定原理与方法 难点 1 DNA一级结构测定的原理与方法2 核苷酸的两性离解3 双螺旋结构的要点 教学目的 1868年 F Miescher从细胞核中分离得到一种酸性物质 即现在被称为核酸的物质 核酸的种类和分布 核酸分为两大类 脱氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid DNA 核糖核酸RibonucleicAcid RNA 核酸的功能 1 DNA是遗传信息的载体2 RNA的功能参与遗传与进化参与蛋白质的生物合成参与RNA转录后的加工修饰参与基因表达调节催化等 第一节核酸的组成成分 一 元素组成 CHONP 9 9 9 RNA P 9 DNA P 9 9 核酸的组成单位 核苷酸核酸的组成成分 碱基 戊糖 磷酸 二 组成成分及组成单位 一 戊糖 组成核酸的戊糖有两种 DNA所含的糖为 D 2 脱氧核糖 RNA所含的糖则为 D 核糖 二 碱基 1 嘌呤 Purine 碱 嘌呤 Purine 2 嘧啶 Pyrimidine 碱 嘧啶 Pyrimidine 胞嘧啶Cytidine C T H3C 胸腺嘧啶Thy 三 核苷 nucleoside 核苷戊糖 碱基糖与碱基之间的C N键 称为C N糖苷键 四 核苷酸 nucleotide 五 核苷酸衍生物 1 继续磷酸化 核酸中也存在一些不常见的稀有碱基 稀有碱基的种类很多 大部分是上述碱基的甲基化产物 2 稀有碱基 7 甲基鸟苷m7G 取代核苷的表示方式 假尿苷 次黄苷 肌苷 I 黄嘌呤核苷X 二氢尿嘧啶核苷D 3 环化磷酸化 cAMP cGMP 4 肌苷酸及鸟苷酸 强力味精 第二节 RNA的分子结构 一 RNA的一级结构 一 连接方式 5 PdAPdCPdGPdTOH3 5 PAPCPGPUOH 或5 ACGTGCGT3 5 ACGUAUGU3 ACGTGCGTACGUAUGU 5 磷酸端 常用5 P表示 3 羟基端 常用3 OH表示 多聚核苷酸链具有方向性 当表示一个多聚核苷酸链时 必须注明它的方向是5 3 或是3 5 多聚核苷酸的表示方式 DNA RNA 二 RNA的降解 1 RNA的化学降解 碱降解 RNA用稀碱降解产物为2 核苷酸和3 核苷酸混合物 DNA抗碱 高温不抗碱 酸降解 水解速度糖苷键 脂键嘌呤糖苷键 嘧啶糖苷键脱氧核糖糖苷键 核糖糖苷键在低温的酸性条件下DNA RNA则稳定 2 酶法降解 核酸酶有 外切酶 内切酶和磷酸酯酶 一 RNA的二级结构 二 RNA的高级结构 占RNA总量的15 一种氨基酸对应最少一种RNA分子量25000左右 大约由70 90个核苷酸组成 沉降系数为4S左右 分子中含有较多的修饰成分 3 末端都具有CpCpAOH的结构 1 特点 2 三叶草结构要点 二 tRNA的三级结构 第三节DNA的分子结构 一 DNA的一级结构及测定 1 加减法 2 双脱氧法 dNTP ddNTP的比例最好为1 100 3 化学修饰法 修饰及断裂条件 二 DNA的二级结构 要点 1 多核苷酸链的走向2 螺旋的角度 高度 直径3 碱基分布及配对规律4 作用力 一 双螺旋提出的基础 二 双螺旋结构要点 双螺旋DNA的结构参数 三 双螺旋的结构类型 四 左旋DNA Z DNA 要点1 左旋锯齿状2 碱基向外3 只有小沟4 12bp 4 56nm 五 绞链DNA hing DNA即H DNA 三 DNA的三级结构 第四节核酸及核苷酸的性质 一 溶解性 DNA在PH4 2时溶解度最低 RNA在PH2 2 5时溶解度最低 1 水溶性 微溶于水 不溶于有机溶剂 水中溶解度DNA达2 RNA达4 2 盐溶性 DNA 蛋白 溶于1mol LNacl 低盐不溶 RNA 蛋白 溶于0 14mol LNacl 高盐不溶 3 不同PH的溶解性 二 两性性质 1 腺嘌呤 2 鸟嘌呤 4 尿嘧啶胸腺嘧啶 3 胞嘧啶 三 核酸的紫外吸收特性 在核酸分子中 由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系 因而具有独特的紫外线吸收光谱 一般在260nm左右有最大吸收峰 可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据 以A260 A280进行定性 定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭 EB 在紫外下发出荧光 四 核酸的变性与复性 一 变性 变性 稳定核酸双螺旋次级键断裂 空间结构破坏 变成单链结构的过程 核酸的的一级结构 碱基顺序 保持不变 变性表征 生物活性部分丧失 粘度下降 浮力密度升高 紫外吸收增加 增色效应 变性因素 pH 11 3或 5 0 变性剂 脲 甲酰胺 甲醛 低离子强度加热 热变性和Tm DNA的变性过程是突变性的 它在很窄的温度区间内完成 因此 通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度 用Tm表示 一般DNA的Tm值在70 85 C之间 DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关 G和C的含量高 Tm值高 因而测定Tm值 可反映DNA分子中G C含量 可通过经验公式计算 G C Tm 69 3 2 44 二 核酸的复性 变性核酸的互补链在适当的条件下 重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性 DNA复性后 一系列性质将得到恢复 但是生物活性一般只能得到部分的恢复 具有减色效应 将热变性的DNA骤然冷却至低温时 DNA不可能复性 变性的DNA缓慢冷却时可复性 因此又称为 退火 退火温度 Tm 25 复性影响因素片段浓度 片段大小 片段复杂性 重复序列数目 纯度 溶液离子强度 三 核酸的复性与分子杂交 第五节核酸及其组分的分离纯化与测定 一 分离纯化的一般原则 1 防止核酸酶降解2 防止化学因素降解3 防止物理因素降解 二 DNA的分离纯化 三 RNA的分离纯化 四 核酸组分的分离纯化 1 离子交换法 四种核苷酸之间的分离采用离子交换法阳离子交换剂洗脱次序 阴离子交换剂洗脱次序 2 凝胶过滤法 碱基 核苷 核苷酸之间的分离采用Sephadex G10 G25 核苷一磷酸 核苷二磷酸 核苷三磷酸的分离采用柱层析和薄层层析法分离 柱层析洗脱次序AMPADPATP薄层层析迁移次序AMPADPATP 3 DEAE 纤维素法 五 核酸及其组分含量的测定与纯度测定 一 核酸含量的测定方法 1 紫外吸收法 1ug mlDNAA260 0 021A260 50Ug mlDNA1ug mlRNAA260 0 022 0 0241A260 40Ug mlRNA 2 定糖法 20 250ugRNA 40 400ugDNA 3 定磷法 10 100ug核酸 4 凝胶电泳 EB 0 5ug ml 染色 最小检出量1ng 二 核酸纯度的测定 1 紫外吸收法 测定A260与A280 2 凝胶电泳 3 等密度梯度离心 凝胶电泳 等密度梯度离心 第六节核酸研究的常用技术 一 DNA的凝胶电泳 一 琼脂糖凝胶电泳 1 琼脂糖凝胶浓度及选择2 琼脂糖凝胶电泳的分辨率3 琼脂糖凝胶电泳的用途 分离 测量 回收 印迹 二 PAGE电泳 1 PAGE浓度及选择2 PAGE电泳的分辨率3 PAGE电泳的用途 三 影响凝胶电泳Rf值的因素 1 分子大小2 分子构象3 凝胶浓度4 电流电压5 温度 二 印迹技术与分子杂交 一 印迹技术 概念 核酸的杂交中 经过凝胶电泳分离的DNA RNA分子 杂交之前通过毛细管吸附作用 电导作用将凝胶中DNA RNA分子原封不动地转移到滤膜上 滤膜 硝酸纤维素滤膜 DEAE 纤维素滤膜 印迹种类 Southernblotting 1975 Northernblotting 1979 Alwine 1979 Towbin Immunoblotting Western 1982 Reihart Eastern 电转移技术 1983 Aubertin 二 核酸杂交 核酸杂交的概念 DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程 这样形成的新分子称为杂交DNA分子 核酸杂交方法 Southernblotting杂交技术 Northernblotting杂交技术 点杂交技术 菌落 噬菌体的原位杂交技术 三 杂交检测方法 放射自显影 点杂交 三 PCR技术 DNAPolymeraseChainReaction 一 基本步骤 二 PCR技术的应用 1 遗传病 疑难病的诊断及产前检查2 病原体的检测3 癌基因的检查4 基因组测序5 基因