婴幼儿配方乳粉胆碱的测定修改说明.doc

婴幼儿配方乳粉胆碱的测定修改说明1、任务来源、起草单位、验证单位和主要起草人 任务来源：国家标准化委员会起草单位：验证单位 ：黑龙江省乳品工业技术开发中心。 主要起草人：2、原标准中胆碱测定方法简介GB/T5413.20-1997中规定了酶比色法测定婴幼儿食品和乳粉中胆碱的方法。该方法是等同采用AOAC的方法。自1997年GB/T5413颁布以来，我中心开展婴幼儿配方食品和乳粉中胆碱的测定工作。经过长时间的大量试验，认为酶比色法测定胆碱的重现性、准确性都较好。由于该方法使用的两种酶制剂价格昂贵、全部需进口，且测定要求实验室条件较高，所以目前国内只有个别外资与国内几家大型乳粉企业使用该方法测定胆碱。而绝大多数企业(包括质检机构)由于受条件限制未采用此方法。2008年4月全国乳品标准化中心在哈尔滨组织召开了由多家乳品企业及质检机构参加的关于GB/T5413修订研讨会上，许多专家提出：为适应国内目前状况，能否增加较为操作简便、稳定性好的化学方法雷氏盐比色法。我中心因在此之前已开展了对该方法的技术资料收集及方法的研究工作。会上一致决定由我中心负责起草该标准方法。 2005年我中心接受了国家标准化委会对婴幼儿配方食品和乳粉通用检验方法修订的工作。在此情况下,经多方查找资料，并进行了大量的试验验证后，认为雷氏盐比色法测定胆碱是一个较为经典、可靠的方法。该方法操作简便、测定重现性与再现性较好，不须特殊的仪器设备与试剂，一般实验室都具备条件， 利于各乳品企业使用等特点。3、雷氏盐比色法测定胆碱的必要性及意义胆碱（choline）是一种维生素，是人体所需要的重要营养素。胆碱是抗脂肪肝因子，可预防脂肪沉积以肝脏中，加速脂肪进入细胞的活动，帮助调节肝和胆囊的功能，可预防胆结石。缺乏胆碱会引起胃溃疡、胃出血、心脏疾病、肾管阻塞、动脉硬化等疾病。胆碱一般以磷酸胆碱或乙酰胆碱的形式广泛分布在卵磷脂、蛋黄、肝脏、啤酒小麦芽中。成年人可以从食物中获取，所以成年人中尚未发现胆碱缺乏者。对全部依靠婴幼儿配方乳粉提供营养的婴幼儿而言，胆碱也是必不可少的营养成分之一被添加到婴幼儿配方乳粉。作为配方成分之一，企业对产品质量监控与政府部门执法都需要建立相应的检测标准。原标准中测定胆碱的方法为酶比色法，由于该法存在较大的局限性，受条件限制，绝大多数企业等都无法采用该方法测定胆碱。为此在标准研讨会上许多代表建议增加适于企业采用且能准确测定胆碱的化学方法，以利于企业等对产品质量的监控。所以增加雷氏盐法是广大生产部门及多数质检机构所需，企业对确保产品质量及政府执法提供技术保障，具有重要的现实意义。4. 制定标准的原则和依据。在所查阅的很多文献中，雷氏盐比色法测定胆碱适应性较广，可适用于几乎所有的食品及添加剂等。目前在现行的国家标准GB/T17481-1998预混料中胆碱的测定 分光光度法、行业标准HG/T 2941-2004饲料级 氯化胆碱中，采用的就是雷氏盐法，方法原理与本方法基本相同，只是前处理及收集雷氏盐方法有所差异。本方法研究借鉴于营养学报1993年6月第15卷第2期上发表的论文婴儿奶粉集食品中胆碱的测定。经过大量试验，进一步完善了实验条件，形成了现在的测定方法。在本实验条件下，测定胆碱的线性范围为0-5mg/mL，线性回归方程y=1.661400e-02+3.86303e*x；相关系数为0.9992。本方法与国标中方法相对照得到满意的结果。该方法与原国标中的方法进行了比对实验，通过对两方法测定结果进行的统计分析表明：两者测定结果见无显著差异。5 标准主要条款的说明5.1 范围 适用于婴幼儿配方食品和乳粉中胆碱的测定。5.2 方法原理食品中的胆碱包括游离态和结合态两种形态，用氢氧化钡甲醇氯仿混合溶液抽提水解样液经过弗罗里硅藻土层析，与水解产物分离，在柱子上与雷纳克铵盐溶液形成粉红色的胆碱雷纳克盐，用丙酮溶解洗脱，于526nm测定吸收值5.3 样品处理胆碱在奶粉及米粉样品中主要以磷酸胆碱和乙酰胆碱的形式存在，而强化胆碱主要以氯化胆碱的形式存在。首先要经过水解，水解的作用就是要使结合态的胆碱游离出来。称取10g左右的样品于磨口三角瓶中，加入50ml氢氧化钡甲醇氯仿抽提液，上接冷凝管，在792的水浴锅内水解小时，不时地摇动三角瓶，使样品不结块水解温度是样品前处理的关键控制点，因为水解温度会直接影响水解效果。温度过低容易使样品水解不充分；温度过高，又会因胆碱的不稳定性使其分解损失，造成结果偏低。所以要严格控制水浴温度，要选用恒温控制良好的水域锅。5.4 实验使用试剂5.4.1胆碱标准品本实验使用的胆碱标准品没有采用氯化胆碱。主要是因为氯化胆碱极易吸潮，遇热不稳定，故采用酒石酸胆碱作标准品。酒石酸胆碱性质稳定，在配制使用过程中基本无变化，且含有的极少量水分，放在干燥器中2小时以上即可除去。该标样要现用现配。5.4.2雷氏盐雷氏盐全名为雷纳克铵盐（Ammonium Reineckate）。该试剂要求纯度要高，否则对显色会产生干扰。该试剂需要现用现配。5.4.3层析柱层析柱的填料为弗罗里硅藻土（60120目），且经过650活化后的吸附效果好。层析柱只能一次性使用。5.5标准曲线的绘制从1g/L的胆碱标准工作液中，分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，注入层析柱中，按样液层析步骤，收集粉红色的胆碱雷纳克盐丙酮标准溶液并定溶于10ml。以丙酮为空白，在526nm处测定其吸光值。以胆碱含量为横座标，吸光值为纵座标，绘制标准曲线。胆碱标准曲线及吸光值回归方程与相关系数胆碱含量mg0.991.982.973.964.95吸光值0.05380.09580.12840.17180.207回归方程y=1.661400e-02+3.86303e*x相关系数0.999230由此可见在一定胆碱浓度为0-5mg/mL内符合比尔定律。5.6 结果分析与计算通过从工作曲线上查得样液中胆碱的含量，可计算出试样中胆碱的含量。注意若以酒石酸胆碱作来来表示标准溶液浓度时，与胆碱的换算系数为0.474。即最终结果应以胆碱表示。5.7 最低检出险 根据GB/T5009.1-2003，中A 2.2 吸光法和荧光法中的计算方法。计算检出限：式中：b标准曲线回归方程中的斜率。s二次空白值的标准偏差;K根据一定置信度确定的系数,按3计算。确认试样检出限为5mg/100g。5.8 准确度的计算为了确定本方法的准确度,根据GB/T5009.1-2003，我们选用了三个不同水平的奶粉样品作回收率试验。实验室水平本底值（mg/100g）添加量（mg）实测值（mg）回收率（g）平均回收率（g）国家乳制品质量监督检验中心水平152.261010.51105.198.80水平2 60.351514.3595.67水平3 70.123028.6995.636 实验室间方法验证由于本标准含盖了婴幼儿配方方食品和奶粉，所以我中心根据方法验证要求，分别制备婴幼儿配方奶粉与婴幼儿配方米粉各三个水平的样品供实验间方法验证。由于时间关系，只有两家实验室参加其验证工作：青岛圣元营养乳品有限公司中心实验室与国家乳制品质量监督检验中心。验证结果如下：6.1实验室内精密度青岛圣元营养乳品有限公司中心实验室胆碱测定结果编号水平奶粉米粉123456185.1692.9652.68122.5893.5570.82286.5295.7454.15118.5093.0773.15383.8093.0151.22126.6594.0370.11483.4494.1853.58124.6895.1871.56582.1891.8752.77120.8692.8869.87687.2590.1754.02119.9894.7571.06平均值84.7392.9953.07122.2193.9171.10标准偏差1.941.911.093.050.921.18相对标准偏差%2.292.052.052.500.981.66国家乳制品质量监督检验中心胆碱测定结果编号水平奶粉米粉123456187.1990.0150.35125.6895.2570.82289.2292.3050.36123.1593.2967.98384.4091.1453.00125.3594.9371.81487.1292.3252.05126.9898.8566.96586.0090.8549.06127.0297.8169.97688.3592.2148.02129.6599.7965.56平均值87.0591.4750.47126.3196.6568.85标准偏差1.710.961.842.162.542.41相对标准偏差%1.961.053.651.712.623.506.2精密度的计算6.2.1 测试结果一致性和离群值的检验：（依据GBT 6379.2-2004 测量方法与结果的准确度 第2部分 确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法计算。从以上两个实验室的八个数据中取前六个数据进行计算。表1 胆碱测定原始数据 mg/100g实验室测定次数水平123456青岛圣元营养乳品有限公司中心实验室（1）185.1692.9652.68122.5893.5570.82286.5295.7454.15118.5093.0773.15383.8093.0151.22126.6594.0370.11483.4494.1853.58124.6895.1871.56582.1891.8752.77120.8692.8869.87687.2590.1754.02119.9894.7571.06国家乳制品质量监督检验中心（2）187.1990.0150.35125.6895.2570.82289.2292.3050.36123.1593.2967.98384.4091.1453.00125.3594.9371.81487.1292.3252.05126.9898.8566.96586.0090.8549.06127.0297.8169.97688.3592.2148.02129.6599.7965.56表2 胆碱含量的单元平均值 （mg/100g）实验室i水平j奶粉米粉123456yijnijyijnijyijnijyijnijyijnijyijnij184.73692.99653.076122.21693.31671.106287.05 691.47650.476126.31696.65668.856表3 胆碱含量的标准差实验室i水平j奶粉米粉123456 sijnijsijnijsijnijsijnijsijnijsijnij11.9461.9161.0963.0560.9261.18621.7160.9661.8462.1662.5462.416用柯克伦检验检验实验数据是否有歧离值和离群值。根据GB/T6379.20047.3.2.1中的规定：如果检验统计量小于或等于5%临界值，则接受检验的项目为正确值；如果检验统计量大于5%临界值，但小于或等于1%临界值，则称被检验的项目为歧离值。但可参与计算。如果检验统计量大于1%的临界值，则被检验的项目称为立群值。予以剔除。在本实验中，P=2,n=6柯克伦检验1%临界值为0.937， 5%临界值为0.877。柯克伦检验统计量： 表4柯克伦统计量计算值：水平实验室柯克论统计量16.68773.7636实验室10.56324.56973.6481实验室10.79934.57373.3856实验室20.738413.96819.3025实验室10.66557.29806.4516实验室20.88467.20055.8081实验室20.807由此可知只有水平5实验室2的数据为歧离值，其它检验数据均为正确值，均可参与数据统计。6.2.2 ，srj和sRj的计算6.2.2.1 总平均值的计算以水平1为例水平1：=85.896.2.2.2方差的计算 根据GB/T6379.2-2004中7.4.4和7.4.5中所定义的诸方差计算以水平1为例：重复性方差： =3.344 实验室间方差：=16.147 =6重复性标准差 =1.829 再现性方差： 再现性标准差 =2.341依次对水平2、3、4、5、6进行计算，其结果见表5。6.2.3精密度与m的关系表5 样品中的胆碱含量和的值水平j1285.891.8292.3412292.231.5091.7463251.771.5132.29842124.262.6443.7715294.981.9102.6086269.981.8982.350对表5种的数据进行检查，、于m之间无明显相关性，因而采用其平均值作为重复性与再现性标准差。6.2.4结论测量方法精密度（以毫克每百克表示）可引述如下：重复性标准差=1.883重复性限（r）（2.8）=5.272再现性标准差=2.519再现性限 ( R) (2.8)=7.053附录从实验室间试验结果得到的统计数据和其它数据样品标示奶1奶2奶3米粉1米粉1米粉1参加试验室的数目222222可接受结果