人类染色体细胞遗传学技术

人类染色体细胞遗传学技术 云南省第一人民医院遗传诊断中心唐新华 人类染色体细胞遗传学技术 染色体制片原理和过程染色体命名的国际标准ISCN 2005 染色体图像分析的经验图像分析仪的运用 一 染色体制片原理和过程 一 细胞及细胞周期 二 从DNA到染色体 三 染色体制作原理 四 染色体制作过程 五 不同来源标本的染色体制作 六 染色体的显带技术 一 细胞周期及有丝分裂 细胞 生物体结构和功能的基本单位 也是生命活动的基本单位 图略 细胞周期 指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程 G1期 指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间 S期 指DNA复制的时期 G2期 指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间 M期 细胞分裂开始到结束 G0期 间期细胞 细胞周期之外的细胞 一 有丝分裂 二 从DNA到染色体 DNA 螺线管 超螺线管 染色单体 核小体 压缩7倍 压缩40倍 压缩6倍 压缩5倍 共计压缩8400倍 核小体nucleosome 染色质的基本结构 DNA分子的不同存在形式 染色质和染色体 染色质 间期细胞核中遗传物质的存在形式 染色体 分裂中期遗传物质的存在形式 一条染色体是一个DNA分子 染色质 根据在分裂期和间期的染色不同 分为 常染色质 在间期核中分布较稀疏 浅染色 是转录活跃的DNA部分 一般位于核中央 在分裂期 位于染色体臂 深染色 含大量功能基因 异染色质 是呈凝集状态的DNA与组蛋白的复合物 由于螺旋化程度高 又称为浓缩染色质 一般位于核内膜的边缘形成一薄圈 即称周围染色质 主要位于位于染色体的着丝粒 次缢痕 端粒等位置 间期和分裂期都深染色 基本无功能基因 染色体 在细胞周期的有丝分裂中期 染色体的形态结构比较稳定 一般所描述的染色体的形态结构都是中期染色体 染色体结构 短臂p 长臂q 着丝粒 主缢痕 端粒 次缢痕 随体 染色体的多态性 随体 9号臂间倒位 次缢痕 染色体 染色体组型 又称核型 是指将动物 植物 真菌等的某一个体或某一分类群 亚种 种 属等 的体细胞内的整套染色体 按它们相对恒定的特征排列起来的图像 核型模式图 是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来 再按长短 形态等特征排列起来的图像 从DNA到染色体 请找出右图一个错误 Cell 三 染色体制作原理 只有可以分裂的活细胞 才能制备染色体 使用秋水仙素或者秋水仙碱破坏纺锤丝的形成 将细胞阻留在有丝分裂中期 从而获得大量的细胞中期分裂相供染色体分析 细胞低渗技术使细胞中的染色体在玻片上铺散得更好 易于计数和观察 甲醇 冰醋酸固定液快速杀死和固定细胞 染色体显带技术 使人类能够分辨和观察更为精细的染色体结构 四 染色体检查过程 G显带 培养细胞 秋水仙素处理 抑制中期分裂相低渗 使细胞膨胀固定 染色体形态固定滴片 分散染色体 边缘着火法 冰片法 熏蒸法 显带和染色 显微镜下分析 G显带常见问题及处理 培养细胞 细菌污染 霉菌污染 细胞收获量小 玻片上细胞间期核稀疏 秋水仙素 大量染色体太细长 缠成毛线团样 分裂相很多 但染色体短小 分叉 几乎没有分裂相 低渗 太分散 不分散 固定 太发毛 背景不干净 有大团块深染色物质 四 染色体制作过程 G显带常见问题及处理 滴片 不分散 太分散 显带和染色 没有条带 条带模糊 一个分裂相内 有的染色体有条带 有的没有 有的胰蛋白酶消化太过 有的分裂相则不足 Giemsa染不上色 染色太深 染色太浅 四 染色体制作过程 五 各种组织标本的染色体制作 不同的标本 不同的检查目的 需要调整染色体的制作过程 处理原则 使尽可能多的细胞进入细胞周期 旺盛生长 大量分裂 防止污染 五 各种组织标本的染色体制作 外周血 5 小牛血清RPMI 1640 PHA 检查体细胞核型 骨髓 10 小牛血清RPMI 1640 防PHA污染 检查肿瘤细胞核型 羊水 标本珍贵 GIBICO全培养基 防止母体细胞污染 检查胎儿细胞核型 绒毛组织 同上 细胞为细胞团 组织 防止细菌污染 清洗 剪碎后消化成单细胞或者细胞团培养 检查胎儿核型 脐带血 血液细胞 性质同外周血 一定注意防止母体污染 检查胎儿核型 活检组织 如实体瘤标本 细胞系 永生细胞 直接常规制作染色体标本即可 六 染色体显带技术 处理方法及应用G显带胰酶处理 Giemsa深带浅带Q显带氮芥奎丫因荧光亮带暗带R显带盐溶液处理 Giemsa 反带 与G带和Q带相反T显带加热后Giemsa染色 末端带 对端粒染色C显带碱处理 Giemsa 显示异染色质部分 N显带AgNO3 染核仁组织者区的酸性蛋白 随体结构 胰蛋白酶消化Giemsa染色G显带 GTG G bandsbytrypsinusingGiemsa 六 染色体显带技术 Q显带 六 染色体显带技术 氢氧化钡处理Giemsa染色C显带 CBG C bandsbybariumhydroxideusingGiemsa 六 染色体显带技术 热处理Giemsa染色R显带 RHG R bandsbyheatingusingGiemsa 六 染色体显带技术 脆性X 七 其它染色体技术 高分辨带染色体技术 染色体脆性检测技术 FISH技术CGH技术 二 染色体命名的国际标准ISCN 2005 AnInternationalSystemforHumanCytogeneticNomenclature 2005 由人类细胞遗传学命名国际标准委员会制定 全世界人类细胞遗传学工作的最重要文件 通用的标准 便于交流 ISCN的发展 1956年Tjio和Levan首次证实了人类染色体数目为46条 1971年 第一张显带的人类染色体核型发表 1977年 在整理前十多年的遗传学会议的结义 制定了 人类细胞遗传学国际命名体制 ISCN 的第一版 包括了人类细胞遗传学命名的完整体系 ISCN 1981 增加了高分辨染色体的内容而成 ISCN 1985 做了一些修订而成 ISCN 1995 增加了原位杂交技术和肿瘤细胞遗传学的内容而形成 ISCN 2005 修订原位杂交技术等内容而形成 染色体描述 描述染色体结构畸变 有简式体系和繁式体系 简式体系 记载好畸变类型和所包括的染色体之后 将断裂点写在括号中列出 断裂点用染色体区带来描述 由短臂到长臂顺序列出 不予分开 如 45 der 13 14 繁式体系 繁式体系通过描述一条染色体从短臂末端到长臂末端的区带的组成 如 46 XX der 1 1qter p22 3q13 3qter 两点断裂重排 当一条染色体的两臂都发生断裂 产生两处断裂的重排时 首先列出短臂的断裂点 再列出长臂的断裂点 46 XX inv 2 p2lq31 当两处断裂发生于同一臂时 则首先列出离着丝粒较近的断裂点 46 XX inv 2 p13p23 当断裂发生于两条染色体 先列出编号较小的染色体 但如果重排染色体中有一条是性染色体 则该染色体首先列出 46 XY t 12 16 q13 pl1 46 X t X 18 p11 q11 三点断裂重排 在三处断裂重排的染色体描述中 一般性染色体或者是编码最小的染色体首先列出 但对于那种一条染色体的一部分插入另一条染色体的断裂和重排而言 不管其是性染色体或者是编码小于受体染色体的常染色体 供体染色体最后列出 46 X ins 5 X p14 q21q25 46 XY ins 5 2 p14 q22q32 对于包括三条染色体的易位 每条染色体上都有一处断裂 则遵循前述原则 即性染色体或者编码最小染色体首先列出 第一条染色体片段的受体染色体依次列出 最末列出第一条染色体的供体染色体 46 XX t 9 22 17 q34 q11 q22 9号染色体的q34远端片段易位至22号染色体的q11 22号染色体的q11远端片段易位至17号染色体的q22 17号染色体q22的远端片段易位至9号染色体的q34 不能确定的染色体或带的命名 问号 一般表示一条染色体或其结构可疑的描述 问号一般置于不能确定的染色体或区带之前 也能代替不能确定的一条染色体 一个区或带 45 XX 2146 XY del 1 q 23 还不能确定断裂点是否在l号染色体长臂的2区 如果是的话 则断裂点在1q23 不能确定的断裂点和染色体数 在描述断裂的定位时 波浪号 用于表示断裂可能发生的区的边界 46 XX del 1 q21 24 or 一般用来表示一种畸变的其它可能 在该符号之前和之后应有空格 46 XX add 19 p13orq13 核型中染色体异常的排列顺序 异常的X最先 异常的Y 按常染色体编码顺序而不是按变异类型列出常染色体异常 对于每个染色体 数目异常先于结构畸变列出 先增加后减少 同系染色体如有多种结构异常 那么这些异常依照表示这些异常的简写术语的字母顺序列出 47 X t X 13 q27 q12 inv 10 p13q22 21不确定的环状染色体 标记染色体和双微体最后列出 52 XX r mar 12 20dmin未知着丝粒起源的衍生染色体应该列于所有可定染色体异常之后 但是列于不定环状染色体 标记染色体和双微体之先 52 XX der t 6 r mar 5 9dmin 和 符号 或 放在正常染色体或者畸变染色体之前表示多余的或丢失该染色体 如 2l 7 der 2 等置于染色体长臂 q 或短臂 p 后的 或 表示染色体臂长度的增加或减少 例如4p 5q 等 但在文字描述中使用 核型描述中不能使用 又举例 16qh Yqh 21ps 13pstk 13cenh pat结构重排的染色体代替正常染色体时 不能把正常染色体记录为丢失 der 嵌合体的表示 不同细胞系的核型描述用斜杠 分开 在核型后面 中记录各细胞系的了的细胞分析数目 46 XY 12 46 XY t 9 22 q34 q11 8 为了区别染色体嵌合体 来自同一合子的细胞系 和异源嵌合体 来自不同合子的细胞系 用mos表示染色体嵌合体 用chi表示异源嵌合体 例如mos45 X 46 XXchi46 XX 46 XY add和del add 未知来源的染色体片段增加 del 染色体末端和中间缺失 add并不描述任何特定染色体形成机制 46 XX add 19 p13 附着于染色体末端的附加物质常会导致染色体臂的长度的增加或减少 这种长度的改变取决于附加物质的大小 出现 1p 和 1p 1p 或 1p 或 5q 或 del 5q 之类的描写可以在文章中使用 但不可用于核型的描述 核型描述中使用add和del要语法正确 如 46 XY del 5 q 染色体多处缺失 但有至少一部分可以识别 用der表示 der衍生染色体 衍生染色体 der 是一种包括两条以上染色体的重排或者是由于一条染色体内的多种畸变而产生的结构重排的染色体 常用于描述具有完整着丝粒的染色体 该术语不能用于描写获得性的染色体异常 由两条或多条染色体重组产生的衍生染色体列于括号中 然后再列出异常类型 一条异常的染色体 只要有一个片段可以识别 都可以描述成这一条染色体的衍生染色体 der衍生染色体 46 XX der 1 t 1 3 p22 q13 46 XX der 1 1qter 1p22 3q13 3qter 由3号染色体3q13远端的片段和1号染色体短臂上1p22处相连组成的1号衍生染色体 l号衍生染色体代替了正常的1号染色体 但没有必要把丢失的染色体表示出来 有两条正常的3号染色体 由于丢失1p22一pter片段以及获得3q13 qter 所以该核型是非平衡的 dic双着丝粒染色体 dic用于描写双着丝粒染色体 等臂双着丝粒染色体可描述为idic 双着丝粒染色体代替了一条或是两条正常染色体 没有必要标明丢失的染色体 双着丝粒染色体一般记为一条染色体 45 XX dic 13 13 q14 q32 45 XX dic 13 13 13pter 13q14 13q32 13pter 同源的两条13号染色体 断裂和重接位于13q14和13q32 从而组成一双着丝粒染色体 没有正常的13号染色体 如果该双着丝粒染色体是由姊妹染色单体的断裂和重接产生 则可描述为dic 13 q14q32 dup重复 一条染色体内片段的重复 46 XX dup 1 q22q25 46 XX dup 1 pter q25 q22 qter 1q22和1q25带中的片段的正向重复 46 XY dup 1 q25q22 46 XY dup 1 pter q25 q25 q22 q25 qter or pter q22 q25 q22 q22 qter 1q22和1q25带之间的片段的倒位重复 注意只有繁式体系才能清晰描述重复片段的方向位置 fra脆性位点 脆性位点脆性位点 简写为fra 能作为正常多态以及与特定疾病相关和 或表型异常 在上述三种情况 可使用同一种命名 46 X fra x q27 3 女性核型 X染色体的q27 3有一脆性位点 46 Y fra x q27 3 男性核型 X染色体q27 3有一脆性位点 inv倒位 inv表示倒位 从带的描述中可清楚知道是中心性或近中心性倒位 46 XX inv 3 q21q26 46 XX inv 3 pter q21 q26 qter 近中心性倒位 断裂和重接发生于3q21和3q2646 XY inV 3 p13q21 46 XY inv pter p13 q21 p13 q21 qter 中心性倒位 断裂和重接发生于3p13和3q21 i等臂染色体 使用符号i来表示等臂染色体 idic表示等臂双着丝粒染色体 等臂染色体的断裂定位于着丝粒pl0和q10 这是依据其形态确定的 46 X i X q10 46 X i X qter q10 q10 qter 一条正常的X染色体和一条长臂具有等臂染色体的x染色体 46 XX idic 17 p11 46 X idic 17 qter p11 pll qter 由17号染色体的长臂和着丝粒附近的短臂物质组成的等臂双着丝粒染色体 断裂点位于17p11 mar标记染色体 标记染色体 mar 是一种结构异常染色体 该染色体中没有一个部分可予确定 只要能识别标记染色体的任何部分 则该染色体可被视为衍生染色体 der 同时可使用衍生染色体的命名予以充分描述 mar的描述前必须写上 号 不要努力去描写核型中标记染色体的形状或大小 诸如微小mar A sizemar等等的使用不予鼓励 如果某信息是相关信息 则可在文章中予以文字描写 47 XX t 12 16 q13 p11 mar除了有t 12 16 还有一条标记染色体 mar标记染色体 当以克隆形式出现几种不同的标记染色体时 可通过在符号mar之后添加阿拉伯数字予以表示 即marl mar2 etc 必需强调marl mar2并不表示从1号染色体 2号染色体衍生而来的标记染色体 通过在mar之后写上乘号可表示同一标记染色体的几条复制染色体 如mar1 2表示两条标记染色体1 mar1 3表示3条标记染色体1 只要能够识别异常染色体中的任一部分 甚至着丝粒的起源未知 这种畸变染色体描述为der而不是mar dmin双微体 双微体 简写为dmin 当出现在一个以上的中期细胞中 代表了一种可记录在核型中的特殊的无着丝粒片段 请注意 双微体不能计数在染色体数目当中 并且该符号前不要写上加号 49 XX 3mar 9 34dmin肿瘤细胞 该细胞系大约有9 34个双微体存在于每个细胞中 r环状染色体 r表示环状染色体 可由一条或多条染色体组成 由一条染色体衍生的环状染色体在影响单个染色体的其它重排中 带的描述不以半分号隔开 46 XX r 7 p22q36 46 XX r 7 p22 q36 环状染色体 断裂和重接发生于7p22和7q36 这些断裂点的远端已缺失了 由一条以上的染色体衍生的环状染色体可能包括一个或多个着丝粒 单着丝粒环状染色体常被视作为衍生染色体 提供着丝粒的染色体首先列出 从断裂点排列的顺序很容易知道无着丝粒片段的起源 der 1 r 1 3 p36q23 q2lq27 der 1 1p36 lq23 3q21 3q27 由1号染色体组成的环状染色体 断裂点位于1p36和1q23 无着丝粒片段来源于3号染色体的3q21和3q27之间的片段 罗伯逊易位 由和21 22号染色体 近端着丝粒染色体 的长臂通过着丝粒融合产生的特殊类型的易位 该易位通常带有短臂的丢失 这种易位可使用非平衡性整臂易位的命名予以描述 使用符号der 45 XX der 13 21 q10 q10 47 XY der 15 del 15 q22 如何确定染色体断裂位点 染色体断裂位点的确定需要在多个细胞中进行证实 只有少数细胞发生的断裂可能是体外培养诱导的结果 寻找染色体细长 分辨率高的分裂相 比较发生了断裂的染色体和正常的染色体带纹 对照ISCN的核型模式图 确定染色体断裂区带 500