复习思考题-细胞工程.doc

1、 简述细胞工程的定义，主要有哪几个领域的的应用？细胞工程（Cell engineering）是指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术1.动植物人工繁殖技术主要是指采用细胞工程技术实现优良动植物的快速繁殖以及濒危物种的保护。主要技术包括：试管植物、人工种子、试管动物、克隆动物2.新品种培育技术主要是指在细胞、细胞器、染色体、细胞核或组织水平上进行遗传性状改良或培育出生物新品种。具体的细胞工程育种技术包括细胞水平上的原生质体诱变、细胞融合技术；细胞器水平上的细胞重组；染色体水平上的多倍体、单倍体育种；以及雌（雄）核发育、胚胎嵌合等。3.生物制品生产技术利用动植物细胞、组织培养或者转基因动植物生物反应器生产生物制品是现代细胞工程的一个代表性领域，主要包括食品、药物、生物能源等。基于细胞培养的生物制品生产不受气候、季节等限制，同时可以采用代谢工程方法改善、调控积累产物，大量获得药物原料和其它有用物质以植物或动物细胞作为表达载体制备相关药用产品也已成为生物制药的热点方向。近年来，以杂交瘤细胞培养大量制备单克隆抗体、动物细胞培养生产疫苗、生长因子等已经产生了可观的经济与社会效益。以转基因动物为代表的生物反应器在生物制药领域已经展现巨大的应用潜力。蓝藻、绿藻、光合细菌等一些单细胞生物可以在特定条件下产生氢气，硅藻等微藻富含油脂，一些微生物具有利用纤维素等原料生产乙醇的能力，因此，微藻细胞高密度培养产氢、制备生物柴油以及微生物发酵生产乙醇等大有可为4.细胞疗法与组织工程干细胞是当今生命科学最前沿领域，有望给现代医学带来一场革命。利用培养的细胞或者离体再造的组织修复受损细胞与组织或器官的技术，属于细胞工程最新发展领域之一2、 什么是体细胞杂交？在育种上有什么意义？将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的过程称为体细胞杂交克服有性不亲和性，实现远源遗传重组3、 分析激素在植物再生过程中的作用。植物激素(Phytohormone)是植物自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物。能影响生长和分化。在个体发育中，不论是种子发芽、营养生长、繁殖器官形成以至整个成熟过程，主要由激素控制。植物激素的作用机理：植物体内的激素与细胞内某种称为激素受体的蛋白质结合后，影响DNA、RNA和蛋白质的合成，并对特殊酶的合成起调控作用，从而表现出调节代谢的功能。（1）启动期：启动诱导外植体细胞脱分化和分裂。用于培养的植物组织多是由已经分化成熟的细胞组成，这些细胞大部分已经丧失分裂能力。由这些细胞诱导产生愈伤组织必须首先使这些细胞恢复分裂能力，变成分生性细胞。主要通过向培养基中添加一定浓度、种类和比例的外源激素刺激外植体细胞改变原来的代谢途径来诱导细胞活化，重新获得分裂能力，需要选择合适的较高浓度的生长素诱导剂（如NAA、IAA、2-4D等）或细胞分裂素启动诱导外植体细胞脱分化和分裂。（2）愈伤组织诱导：即细胞开始分裂并不断增生子细胞的过程。这个阶段一般需要降低激素浓度，有些情况下甚至不需要生长素和分裂素。外植体外层细胞开始分裂并脱分化。质量好的愈伤组织多呈淡黄（绿）色或无色、疏密适中。（3）拟分生组织的形成：将愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下培养，细胞内部开始发生一系列形态和生理变化，分化出形态和功能不同的细胞。此时，表层细胞分裂减慢，内部的局部细胞也开始分裂。在若干部位出现类似形成层的细胞群，通常称为“生长中心”，又可称为“拟分生组织”，该过程是器官发生的一个转变时期。（4）器官原基和器官的形成：拟分生组织形成后，一些细胞分化成为管状细胞，进而形成维管组织，形成不同的器官原基，进一步分化出相应的组织和器官。大多数情况下，植物再生过程中器官的发生是通过提供适宜的植物激素来实现的。4、 比较植物细胞与植物组织培养两条途径生产次级代谢产物的优缺点。5、 简述植物细胞固定化培养的优点。细胞固定化培养（Cell immobilization culture）是指将游离的细胞包埋在支持物内部或表面进行培养的一门技术o 1.细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小，维持了细胞的稳定性，适合脆弱的植物细胞的培养，同时也利于采用传统生物反应器大规模培养。o 2.悬浮细胞培养体系中细胞密度比较高时会因粘度增加引起传质困难。固定化细胞培养系统中细胞密度远高于悬浮培养，但并不会改变培养液流体性质，利于传质。o 3.细胞生长较为缓慢，利于次级代谢产物的积累。o 4.固定化增加了细胞与细胞间的接触，促进了细胞间信息传递，利于代谢产物的合成。o 5.固定化细胞可以反复使用，可以方便地进行产物的连续性收获，减弱或消除反馈抑制，提高细胞次级代谢产物的产量，降低了成本。6、 为什么多倍体往往高度不育？减数分裂时同源染色体联会时发生紊乱，很难将完整的一套染色体分配到一个配子中去。即：很难形成具有完整一套染色体组的配子。绝大多数配子中的染色体数目不正常。7、 核移植克隆动物与体外受精动物相比有怎样的优点与缺点？细胞核移植（Cell nuclear transfer）是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术。细胞核移植动物：是用特定发育阶段的核供体及相应的核受体（去核的卵子）体外构建重组胚，通过胚胎移植达到受体，发育出生的动物。理论基础：生物的主要遗传物质存在于细胞核中，因此克隆动物可以通过细胞核移植实现。但是，细胞核移植所得到的动物为核质杂种。核移植优点：能克服远缘杂交的不亲和性，有目的地培育优良品种。动物体细胞克隆，可用于保存濒危物种、保持优良品种、挽救濒危动物、利用克隆动物相同的基因背景进行生物医学研究等。 缺点：技术复杂，难度大；它将对生物多样性提出挑战，有性繁殖是形成生物多样性的重要基础，而“克隆动物”则会导致生物品系减少，个体生存能力下降。体外受精(In vitro fertilization，IVF)是指将哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。o体外受精动物也称试管动物（test-tube animal），是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。（1） 发挥优良母畜的繁殖潜力：一头优良品种母牛的卵巢内有几万个生殖细胞，但在一个正常性周期内只有几个卵泡同时发育，最后一个卵泡成熟并排卵。一种优良母畜医生大约只能繁殖10个左右的后代，大部分时间用于妊娠和哺乳。使馆动物繁殖技术能够充分利用母体生殖潜力。（2） 促进家畜改良速度：繁殖能力的提高促家畜改良速度，加速育种过程。（3） 保存遗传资源：对优良或西游哺乳动物简历“胚胎库”，进行受精卵或胚胎长期保存。 (1)囊胚发育率低，细胞数少。体外受精卵在培养过程中普遍存在发育阻断(developmental block)，即胚胎发育到一定阶段后停止发育并发生退化的现象。牛胚胎阻断发生在816细胞阶段，这就导致体外受精卵的囊胚发育率远低于体内受精。此外，与体内受精囊胚相比，体外受精囊胚的细胞总数和内细胞团细胞数明显减少。 (2)产犊率低，胎儿初生重高。家畜体外受精胚胎，特别是牛的IVF胚胎移人受体后，产犊率比体内受精低15%20%，但胎儿初生重比人工授精后代高34kg，导致受体母畜难产率高。8、 核移植克隆动物的技术流程。a) 细胞核移植克隆动物技术环节主要包括：核供体细胞的准备脱离生长周期，进入G0期b) 受体细胞的获得和去核c) 细胞核移植、激活 电融合法d) 重组胚的培养与移植e) 核移植后代的鉴定。9、 分析限制植物细胞培养大规模生产有价值次级代谢产物的影响因素。1.生物因素（1）细胞株稳定、高产、生长速度快的细胞株是细胞大规模培养生产代谢产物的前提。在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时必须弄清楚产物的合成部位，也就是应该考虑到不同部位来源细胞的特性。缺乏适合的细胞株是目前许多代谢产物无法利用细胞培养生产的主要限制之一。（2）细胞凋亡细胞凋亡（Cell apoptosis），也叫程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD），是机体维持环境稳定、有基因控制的细胞自主的有序性死亡。细胞凋亡是植物细胞培养过程中不可避免的现象，但是可以通过条件改变进行调控来减少细胞凋亡。关键是要保证充足的营养供给以及避免有害代谢产物的积累，这可以通过采用合适的培养工艺来实现（3）细胞团植物细胞容易聚集成团，每个细胞团一般由4-300个细胞组成，大小因植物细胞种类不同具有较大差异，例如：烟草细胞团直径大约在350-1000m，长春花细胞团在40-2000m之间。细胞团的形成影响稳定的悬浮体系的维持，同时造成了培养物的显著异质性，细胞团表面与内部的细胞存在营养吸收和代谢产物分泌的差异。此外，细胞团容易受剪切力影响而破碎，引起培养液粘度增加，致使气体交换与传递受到影响。要保持反应器良好的混合效果。适当大小的细胞团有利于代谢产物积累。（4）生物合成机制次级代谢产物的生物合成不同于蛋白质合成，涉及多基因参与（基因簇），机制非常复杂，影响因素非常多。结合目标产物进行生物合成机制研究，揭示代谢途径及诱导合成机制是细胞培养的重要生物学问题，有利于指导建立优化的培养工艺与技术。主要通过合适的培养基选择来控制，包括营养盐、前体和调节因子等。2.化学因素（1）营养盐：一方面是保证植物细胞生物量的增长；另外一方面是要保证细胞能合成和积累次级代谢产物。普通的培养基一般仅能满足第一方面的需要，对于第二方面的需求，必须针对具体的培养对象和目的，对培养基进行优化，从而保证最大限度地积聚目标产物。（2）前体（precursor ）指某一代谢中间体的前一阶段的物质。一般在生物合成反应的中间过程中，某一阶段前的物质，都可以说是该阶段物质的前体物质。缺乏某一种前体时细胞就不能合成某一种代谢物。如果在培养基中加入外源前体将会有助于合成该代谢产物或使其产量增加。（3）诱导子狭义诱导子：是指那些能够与细胞发生相互作用，通过细胞内一系列的信号转导过程，作用于与细胞次生代谢相关的基因表达，进而改变细胞次生代谢相关酶的活力，最终使细胞次生代谢水平发生改变的物质。广义诱导子：是指所有能够提高细胞次生代谢相关酶活力，进而提高细胞次生代谢水平的外界因素。温度、光照、紫外线、红外线等都是广义诱导子。从来源上可以分为外源性和内源性诱导子，后者是指在外界信号刺激下细胞合成的物质。从性质上可以分为生物与化学诱导子。（4）反馈抑制植物次级代谢产物在培养系统的积累有时会对目标产物的合成具有反馈抑制。例如：直线式反馈控制（Straight linear feedback contro) ：当末端代谢产物达到一定浓度时，就会抑制该代谢途径，通常是抑制第一种酶的活性。可以采用流加/半连续培养、两相培养等工艺技术可以克服。3.物理因素主要包括：光照、温度、通气、搅拌、pH值等。（1）光照：光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响。光照时间长短、光质、光强等都会对代谢产物合成和积聚产生作用。光对许多酶有诱导或抑制作用。（2）温度：温度会影响酶的活性。细胞的生长速率与培养温度紧密相关。植物细胞培养一般在5左右进行。（3）pH：会影响培养液的渗透压、酸碱度，酶的活性，从而影响细胞代谢。植物细胞液体培养的pH 变化范围在56 之间，最佳的起始pH在5.55.8 之间。如果对培养液pH进行控制，将有利于次级代谢产物的生成。4.工程技术问题（1）培养液的流变特性由于植物细胞培养过程中容易结团，同时，不少细胞在培养过程中容易分泌粘多糖等物质，从而使传氧速率降低，影响细胞生长。粘度变化可以由细胞本身或其分泌物等引起。前者包括细胞浓度、年龄、大小、结团情况等。（2）气体传递与微生物不同，植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对培养过程影响较大。氧的传递与通气速率、培养液混合程度、培养液流变特性、气液界面面积等因素有关；而氧的吸收与反应器类型、细胞生长速率、温度、pH、营养组成、细胞浓度等相关。（3）搅拌与剪切力为了加强气液固之间的传质，细胞悬浮培养时需要混合搅动。植物细胞虽然有较硬的细胞壁，但是细胞壁很脆弱，对搅拌的剪切力很敏感。由于剪切力比较大，细胞会自溶，次级代谢产物合成会降低。各种植物细胞耐受剪切力的能力不尽相同。烟草细胞和长春花细胞在涡轮搅拌器转速150 rpm和300 rpm时一般还能生长。培养桔叶鸡眼藤细胞时，涡沦搅拌器的转速应低于20 rpm。剪切力影响的克服可以通过低剪切力的生物反应器开发与耐受高剪切力的细胞株筛选来实现（4）泡沫与器壁表面粘附性与微生物细胞培养相比，植物细胞培养过程中产生的气泡更大，而且由于培养液含有蛋白质或粘多糖，粘度大，细胞很容易被包埋在泡沫里，造成非均相培养，也可从营养液中带出来，造成损失或污染。因此，必须对泡沫进行消除。消泡剂、机械去除。10、 微载体培养中球传球接种技术的优点。将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合，实现细胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体表面的技术。o 优点：o （1）避免了细胞收获与微载体再生过程，方便、高效。o （2）防止细胞调亡：通过定期更换微载体也能为细胞的分裂生长提供了新的生长空间，在长期培养过程中保持细胞活力，延长了细胞寿命，提高了细胞分泌物的产量。o （3）模拟了体内三维生长环境，减轻接触抑制，可多层生长。o （4）解决了生物反应器的空间分布问题，单位体积培养液的细胞产率高；o （5）把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点； o （6）可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；o （7）简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；培养基利用率较高； o （8）放大容易，使大规模培养动物细胞成为可能；o （9）方便接种与收获，劳动强度小；o （10）培养系统占地面积和空间小。11、 用图解方式说明花药培养经单倍体获得纯合二倍体的技术路线。12、 什么是干细胞？干细胞培养有什么意义。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。由于可以对干细胞进行体外遗传操作、选择和冻存而不失其多能性，所以在特定条件下可诱导分化为人们所需要的细胞、组织和器官并用于临床治疗。同时，干细胞通过核移植或胚胎嵌合。能得到克隆动物，这对提高优良家畜的繁育效率及拯救濒危动物具有重要意义。干细胞技术在生物学基础研究、农业以及移植医学上具有广阔的应用前景。13、 胚胎干细胞体外培养的关键技术。胚胎干细胞简称ES(Embryo Stem)细胞，是一种全能干细胞，它是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可以分化成任何一种组织类型的细胞。 细胞团获得 1 分离自胚胎内细胞团2 分离自原始生殖细胞3 分离自胚胎瘤细胞原代培养（1）有饲养层培养法：主要应用小鼠胚胎原代成纤维细胞（PMEF）和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养层细胞。（2）无饲养层培养法：是利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基，或者在基础培养基加入重组的LIF等细胞因子制备成条件培养基。保证胚胎干细胞增殖的同时维持未分化的二倍体状态。传代培养（建系）胚胎干细胞细胞系的建立鉴定（干细胞、分化潜能）胚胎干细胞分化潜能评价（1）体外分化实验 将获得的胚胎干细胞制成悬浮液培养在铺有明胶的培养皿中，一段时间后部分细胞贴壁生长，分化成神经、肌肉、软骨等不同组织细胞；同时一部分不贴壁的细胞悬浮生长，先生成“简单类胚体”，进一步培养生成囊状胚体。（2）体内分化实验 将一定量的胚胎干细胞注射进同源动物皮下，经过一段时间后，注射处皮下有组织瘤生成。手术取瘤，常规制片后观察，一般是含有三个胚层的畸胎瘤。（3）嵌合体形成 将胚胎干细胞通过聚集法或者注射法与受体胚胎结合，并且将胚胎移植进同期化代孕母受体，各自表达自己的基因型，最终得到嵌合体动物。14、 对比植物细胞培养、植物组织培养、薇藻培养、