燕麦抗氧化成分的研究.doc

燕麦中抗氧化成分的提取及抗氧化活性的研究 食品科学专业 胡冬梅 2011207336选题背景及意义 燕麦属于禾本科植物，是世界主要农作物之一。燕麦一般分为带稃型和裸粒型两大类，我国栽培的燕麦以裸粒型的为主，常称裸燕麦。美国时代周刊评出的十大健康食品中，燕麦名列第五，并被FDA认可为一种功能性食品。在我国人民日常食用的小麦、稻米、玉米等9种粮食中，燕麦的经济价值最高。燕麦是为数不多的几种全营养谷类食品之一，富含蛋白质、矿物质、维生素及膳食纤维等现代食品营养素，同时，燕麦中氨基酸含量较其它谷物食品更加全面与均衡，含有人体不能自行合成但又必需的氨基酸较多，且其含量接近或超过世界卫生组织推荐值。燕麦优势不仅体现在含有丰富的蛋白质、矿物质、维生素、油脂等营养成分，更重要的是，燕麦中还含有抗氧化活性物质及膳食纤维，因而使燕麦具有降低血糖、降低血脂、提高免疫、抑制脂质氧化及延缓衰老等生理功能。抗氧化性是燕麦诸多生理功能中较为突出的一个。早在20世纪30年代Lowen.L、Peters.F.N 及Musher.S.等人就发现燕麦中含有为数众多的抗氧化成分，并提出将燕麦作为一种抗氧化剂的来源，但是由于当时缺乏有效的分离和鉴定手段，因而不能给出确切的抗氧化成分组成。近年来国外学者对燕麦中的抗氧化成分的组成、抗氧化效果进行一系列研究。研究表明，燕麦中的抗氧化成分主要是各种多酚类物质，如肉桂酸衍生物、对香豆酸、对羟基苯甲酸、邻羟基苯甲酸、4- 羟基苯乙酸、香草醛、儿茶酚等。这些不同组成、不同存在形式的多酚类物质根据其溶解性的不同大致可分为醇溶性和脂溶性两种，它们都具有较好的抗氧化性能。据David M. Peterson报道，燕麦生物碱是在谷物中唯一发现的一种多酚化合物， 具有很强的清除DPPH 自由基能力和抑制-胡萝卜素脱色的作用。Liu等人指出燕麦中的多酚物质具有抗动脉粥样硬化的作用。Lin Nie等人的研究表明燕麦多酚能抑制血管平滑肌细胞的增殖以及提高一氧化氮的生成，从而抑制动脉粥样硬化。除多酚类物质外，燕麦中的维生素E、甾醇、-羟基脂肪酸、皂苷等成分也具有不同程度的抗氧化效果，如燕麦甾醇在常温下对大豆油脂没有抗氧化作用，但在 180时显示一定的抗氧化效果。皂苷类化合物是一类较复杂的苷类化合物，在我们日常食用的谷物中，只有燕麦中含有皂苷，与燕麦中富含植物纤维结合，吸取胆汁酸，促使人体肝脏中的胆固醇转变为胆汁酸随粪便排走，间接降低血清胆固醇。总之，燕麦的抗氧化性能是燕麦中多种物质共同作用的结果，其中一部分物质的结构组成已被鉴定，但仍有一些成分的结构及存在形式有待进一步研究，进而生产高效、安全的天然抗氧化剂。实验内容（1）测定燕麦中抗氧化成分的组成和含量；（2）比较不同品种燕麦之间抗氧化成分的组成及含量的差异；（3）优化现有提取抗氧化成分的方法，探索新方法；（4）测定不同抗氧化成分的抗氧化能力；比较不同品种燕麦抗氧化活性的大小；（5）研究不同不同抗氧化成分之间的协同作用，探究燕麦抗氧化成分作用的机理利（6）为裸燕麦天然抗氧化剂产品的生产提供技术和理论上的支持，推动裸燕麦的综合利用和深加工增值。研究方法 取10种不同品种的燕麦，分别标号1、210。分别测定不同种燕麦及麸皮中各种抗氧化成分的含量及抗氧化能力。1燕麦麸皮中皂苷的提取及抗氧化活性测定1.1燕麦麸皮中皂苷的提取 （1）燕麦麸皮以甲醇为提取溶剂提取35次，合并提取液，离心分离取上清液，将上清液浓缩干燥，收取提取物；（2）将提取物分散于蒸馏水，采用正丁醇萃取，将萃取液回收溶剂得到正丁醇萃取物，干燥，形成干燥产物；（3）将干燥产物经乙酸乙酯处理，挥干溶剂，得燕麦麸皮粗提物；（4）将粗提物上大孔吸附树脂，依次以4555（v/v）和6575（v/v）乙醇水溶液洗脱，收集6575（v/v）乙醇水溶液洗脱液，浓缩，干燥，即得燕麦皂苷。这种方法有效地克服了燕麦内的皂苷与其它化合物难于分离的问题，原料采用燕麦麸皮，成本较低；采用醇水溶液多次提取，抽提效果好且经济效益高；粗提物采用大孔吸附树脂分离，分离后洗脱液洗脱，经浓缩、干燥，所得到的燕麦皂苷纯度较高。1.2燕麦麸皮中皂苷含量的测定1.2.1标准曲线的制作: 准确移取 1.07mg/mL的人参皂昔RG标准品甲醇溶液35mL，70mL，105mL，140mL，175mL于试管中，75水浴30分钟挥干溶剂，依次加入5%(w/v)香草醛乙醇溶液0.20mL和60%H2SO4溶液 (v/v)5.0mL，60水浴加热20min，取出后流水冷却，以试剂空白做参比，用1cm比色皿在535nm处测吸光度。1.2.2皂苷含量的测定测定时，以样品代替人参皂营RG标准品，按上述方法测定皂苷含量。1.3裸燕麦皂苷对卵磷脂脂质体氧化的影响 于样品管中加入1.00，mL脂质体磷酸盐缓冲液分散系（LLS）、1.00mL，400mol/L FeCl3、1.00mL，400mol/L抗坏血酸、1.00，mL样品，充分混匀，避光37水浴60min，加入2.00mL 三氯乙酸（TCA）-硫代巴比妥酸（TBA）-盐酸（HCl），90100水浴15min，迅速冷却，2.000r/min 离心10.min，取上清液 535nm 测定吸光度（As）。空白管以1.00mL相应溶剂代替样品，操作方法同样品管，535nm测定吸光度（Ac）；对照管中加入 1.00mL 磷酸缓冲液（PBS）和5.00mL 相应溶剂，不加热，作为参比.抑制率=（AcAs）/Ac2燕麦中黄酮化合物的提取及抗氧化活性测定2.1燕麦中黄酮化合物的提取 许辉等人（2011）研究发现，回馏法提取燕麦黄酮应选择45%乙醇，以1:3的料液比在70回流3h为最佳条件。影响提取的主要因素是提取剂浓度，其次是料液比，提取温度和提取时间对提取影响较小。超声波提取法提取燕麦黄酮应选择60%乙醇，以1:3的料液比在55提取30min为最佳提取条件。影响提取的主要因素是料液比，其次是温度，提取剂浓度对提取影响显著，提取时间对提取影响很小。回收率分别为63.7%和77.2%。超声波提取黄酮类物质，大大缩短了提取时间，提高了有效成分的提取率和样品的利用率。与常规溶剂提取法相比，超声波提取技术，耗时短、提出率高，提取温度较回流法低，对有效成分的活性影响小，另外超声提取不需复杂设备，所以超声提取优于乙醇回流提取。 本实验要在此基础上继续优化实验条件，并尝试超临近流体萃取法和双水相萃取法提取燕麦中黄酮类化合物。2.1.1超临界流体法 超临界流体萃取主要指超临界CO2萃取，该方法提取率高，无残留溶剂污染，活性成分和热不稳定性成分不易被分解破坏而保持天然特征，可选择性提取和分离纯化，溶剂和溶质分离方便。 通过正交试验，考察压力、温度、时间和CO2流量对黄酮提取的影响，确定最佳试验条件。2.1.2双水相萃取分离法 双水相萃取技术分离原理是物质在双水相体系的选择性分配，该法设备投资少，操作简单，无有机溶剂残留污染。由于天然植物中所含的化合物众多，而双水相萃取技术具有较高的选择性和专一性，因此利用这些技术有希望从天然植物中提取有效药物成分开辟一条新的思路。（1）固液浸取：将燕麦烘干、粉碎，加入乙醇溶液，固液浸取，过滤除杂后得到粗提液；（2）双水相萃取：取上述粗提液，加入聚合物和硫酸铵双水相系统，混匀、分为上、下两相；（3）乙酸酯类反萃：取出富含聚乙二醇聚合物的上相，加水、乙酸酯类和无机盐，混匀，系统在室温下静置分为上、下两相；（4）减压蒸馏、真空干燥：取出含有大量黄酮类物质的乙酸酯类的相，对其进行减压蒸馏、浓缩溶液，然后将该浓缩液进行真空干燥，得到固体黄酮类物质。2.2标准曲线的制作 准确称取干燥恒重的芦丁标准品 5.0mg，用60%微热乙醇定容至50mL，摇匀得浓度为0.lm/mL的标准应用液。准确吸取标准应用液0，1.0，2.0，3.0，4.0， 5.0mL于6只具塞试管中，加30%乙醇使成5mL，加入5%NaNO2溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加10%AI(N03)3溶液0.3mL，摇匀，放置 6min，加1mol/LNaOH溶液4mL，加水0.4mL，摇匀，放置10-15min，于510nm波长处测定吸光度。2.3黄酮化合物含量的测定 测定样品时以样品代替黄酮标准品，按上述方法测定黄酮含量3燕麦中多酚物质的提取及抗氧化活性测定3.1燕麦中多酚化合物的提取 取燕麦样品粉碎机磨成细粉，准确称取10种样品，室温避光条件下，正己烷搅拌提取，提取液离心后过滤，合并提取液减压回收至干，正己烷定容后过0.45m滤膜。样品残渣室温下晾干，浓度80%乙醇搅拌提取2次，过滤并且合并提取液，减压回收乙醇，调pH值至2，乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯层定容后过0.45m滤膜，得燕麦游离型多酚类化合物;下层水液蒸干后，2 mol/LNaOH95碱水解2、4、6、8、10、12 h，用HCl调pH值至2，乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯层减压回收至干，甲醇定容后过0.45m滤膜，得燕麦中结合型多酚类化合物。3.2燕麦中多酚化合物的提取及含量的测定3.2.1标准曲线的制作： 用 10m水溶解 0.05 g没食子酸，定容至 500mL，分别移取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL到100mL容量瓶中，加入 50mL蒸馏水和1 mL福林试剂 ，摇匀后静置 45min， 加入10% Na2CO32 mL，用蒸馏水定容，于25恒温水浴中反应60min，显色后于波长760nm处测定吸光度。3.2.2多酚化合物含量的测定： 准确吸取1mL样品提取液100mL容量瓶中，加入50mL蒸馏水，再加入1mL福林试剂，摇匀，静置45min，加入10mlNa2CO32mL，用蒸馏水定容，置于25恒温水浴锅中反应60min，显色后于波长760nm处测定吸光度。由标准曲线查得相对应的浓度，按下列公式计算多酚化合物的含量。 M=（CVN）/m M多酚含量（g/g）；C没食子酸质量浓度（g/mL）；V提取液体积（mL）；N稀释倍数；m样品质量（g）。3.3多酚化合物抗氧化能力的测定 测定原理：DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基)是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在波长515 nm处有强烈吸收。在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供1个电子与DPPH的孤对电子配对而使其褪色，褪色程度与其接受的电子呈定量关系，在波长515 nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线形关系，即自由基清除剂的清除自由基能力越强，吸光度越小。3.3.1燕麦多酚提取物清除 DPPH自由基能力3.3.1.1标准曲线的制作 准确称取25.03mg标准品Trolox于100mL容量瓶中，加水定容得浓度为1000mol/L的标准储备液， 再以此溶液分别配制浓度为20、40、60、80、100、120、140、160 mol/L 的 Trolox标准梯度液，分别往小试管中加入1mL水及不同梯度的标准溶液，再加入0.1mmol/L DPPH溶液（准确称取7.886mg 的 DPPH于200mL容量瓶中，用无水乙醇定容即可4.5mL，漩涡振荡后避光反应30min，以无水乙醇作空白，于波长515nm处测定吸光度，得到浓度-吸光度曲线。3.3.1.2多酚化合物清除DPPH自由基能力的测定 分别吸取1mL上述不同稀释倍数的样品液于小试管中，分别加入0.1 mmol/L DPPH溶液4.5mL，漩涡振荡后置避光处反应30min，于波长515nm处测定吸光度。由回归方程计算对应的Trolox浓度。以Trolox当量浓度反映燕麦多酚类提取物清除 DPPH自由基的能力。3.3.2多酚化合物铁还原能力的测定（FRAP 法）3.3.2.1标准曲线的制作 分别吸取1mL水和20、40、60、80、100、120、140、160mol/L的Trolox标准梯度液于小试管中，加入TPTZ工作液（以30mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液、10mmol/L TPTZ 溶液、20mmol/L FeCl3溶液按体积比为10:1:1混合配制）4.5mL，漩涡振荡后避光反应30min，于波长593nm处测定其吸光度，得到浓度-吸光度曲线。3.3.2.2多酚化合物铁还原能力的测定 分别吸取1mL上述不同稀释倍数的样品液于小试管中，分别加入TPTZ工作液4.5mL，漩涡振荡后置避光处反应30min，于波长593nm处测定吸光度。 由回归方程计算相对应的Trolox浓度。以Trolox当量浓度反映燕麦多酚类提取物铁还原能力。参考文献1. 汪海波等.燕麦中抗氧化成分的初步研究.食品科学.2003， Vol. 24， No. 72. 裴颖.裸燕麦麸皮抗氧化活性的热稳定性及皂苷鉴定3. 毕重铭.裸燕麦皂苷的提取分离及其抗氧化活性.天津科技大学学报。2008，124. 许辉等.内蒙古燕麦黄酮提取方法比较研究.内蒙古农业大学学报.2011，45. 闫蕊.微博辅助双水相法提取分离芦荟中黄酮类化合物及芦荟多糖的研究6. 刘志敏等.超临界流体色谱法测定银杏叶提取物中的黄酮类化合物.分析化学研究简报.1999，27. 李巨秀等.燕麦多酚化合物提取工艺及抗氧化活性的研究.中国食品学报.2010，108. 刘清等.燕麦酚类抗氧化成分研究进展.粮食与油脂.20049. 时东方等.燕麦中多酚类化合物的分析及抗氧化活性的研究.安徽农业科学.200810. 于志彬.燕麦中多酚类物质提取条件的研究.食品研究与开发.2010，411. 修娇等.燕麦保健功能及其应用J.食品科学，200512.