西妥昔单抗抑制MCF7T AMR乳腺癌细胞增殖及下调FUT4和LeY表达作用的研究.ppt

西妥昔单抗抑制MCF 7 TAMR乳腺癌细胞增殖及下调FUT4和LeY表达作用的研究 大连医科大学附属第一医院肿瘤科袁理王阿曼燕秋刘基巍 研究背景 乳腺癌靶向药物 HER 2为靶点 赫赛汀 Herceptin HER2单抗 拉帕替尼 Lapatinib HER2与EGFR酪氨酸激酶抑制剂 EGFR为靶点 小分子酪氨酸激酶抑制剂 Gefitinib ErlotinibEGFR单克隆抗体 西妥昔单抗 Cetuximab 联合卡铂用于三阴性乳腺癌患者疗效明显 VEGF为靶点 安维汀 Avastin VEGF单抗 CareyLA RugoHS MarcomPK etal JClinOncol 2008 26 15 1009 研究背景 信号转导通路 受体酪氨酸激酶 RTKs 与下游信号转导通路 LewisY寡糖 LeY 细胞表面寡糖抗原 与肿瘤侵袭转移及预后密切相关 岩藻糖基转移酶 FUT4 是催化LeY合成的关键酶 多种上皮来源肿瘤中60 90 存在LeY高表达 包括乳腺癌 研究发现抗体封闭LeY可使小鼠胚胎细胞表面EGFR表达下降 我们在验证西妥昔单抗抑制MCF 7 TAMR细胞ERK途径过度激活的同时 检测了细胞中ERK信号传导通路被抑制前后FUT4和LeY寡糖抗原的表达量 以论证LeY寡糖能否成为乳腺癌治疗的分子靶点以及诊断和判断指标 研究背景 课题设计 GreenMD FrancisPA GebskiV etal AnnOncol 2009 20 11 1813 1817 Oliveras FerrarosC etal IntJOncol 2008 33 6 1165 1176 细胞系MCF 7乳腺癌细胞主要实验方法MTT比色法检测细胞增殖抑制七天连续培养并拍照记录细胞数量 形态RT PCR检测细胞mRNA合成Westernblot检测细胞蛋白表达免疫荧光细胞化学法检测细胞蛋白表达 材料与方法 他莫昔芬诱导野生型MCF 7细胞耐药形成MCF 7 TAMR细胞株 RT PCR检测用药后MCF 7 TAMR细胞PCNA的mRNA合成 加入西妥昔单抗7天连续培养MCF 7 TAMR细胞并拍照 MTT比色法检测不同浓度西妥昔单抗对MCF 7 TAMR细胞增殖的抑制作用并做统计分析 Westernblot检测用药后MCF 7 TAMR细胞PCNA蛋白表达 Westernblot分别检测野生型MCF 7和MCF 7 TAMR细胞EGFR和p EGFR表达情况 实验流程 1 西妥昔单抗对MCF 7 TAMR细胞增殖的作用 RT PCR检测用药后MCF 7 TAMR细胞中FUT4mRNA的合成 间接免疫荧光检测用药后MCF 7 TAMR细胞EGFR磷酸化情况 Westernblot检测用药后MCF 7 TAMR细胞EGFR和ERK1 2的磷酸化情况 Westernblot检测用药后MCF 7 TAMR细胞中FUT4蛋白表达情况 Westernblot检测用药后MCF 7 TAMR细胞LeY蛋白表达情况 西妥昔单抗对ERK通路和LeY FUT4表达的作用 间接免疫荧光检测用药后MCF 7 TAMR细胞FUT4蛋白表达情况 间接免疫荧光检测用药后MCF 7 TAMR细胞LeY蛋白表达情况 实验流程 2 MTT显示西妥昔单抗能够抑制乳腺癌MCF 7 TAMR细胞增殖并呈时间 剂量依赖性 7天连续加药培养显示用药组 h n 细胞形态改变 且数量明显少于对照组 实验结果 1 p 0 017 A ThedifferentinhibitionefficiencyofdrugconcentrationstoMCF 7 TAMRcellsproliferationwasmeasuredbyMTTcolorimetricassay p 0 05 B 7dayscontinuousculturepicturesofnonandcetuximabtreatedMCF 7 TAMRcells 用药组 对照组 实验结果 2 RT PCR及Westernblot显示西妥昔单抗能够抑制MCF 7 TAMR细胞中细胞核增殖抗原 PCNA mRNA和PCNA蛋白的合成 具有剂量依赖性 C ThedifferencesofthePCNAmRNAexpressioninnonandcetuximabtreatedMCF 7 TAMRcellsweredetectedbyRT PCR D ThedifferencesofthePCNAproteinexpressioninnonandcetuximabtreatedMCF 7 TAMRcellsweredetectedbywesternblot 实验结果 3 使用他莫昔芬剂量1 mol L作用MCF 7细胞持续3个月以诱导形成MCF 7 TAMR细胞 3个月后Westernblot检测显示MCF 7 TAMR细胞中EGFR表达量显著高于野生型MCF 7细胞 ExpressionofEGFRandp EGFRinwildtypeMCF 7andMCF 7 TAMRcellsweredetectedbywesternblot 实验结果 4 Westernblot显示西妥昔单抗组和PD98059组的p EGFR蛋白含量均明显低于阴性对照组 西妥昔单抗组p ERK1 2蛋白含量明显低于阴性对照组 间接免疫荧光细胞化学结果显示 西妥昔单抗组 b e 和PD98059组 c f 的p EGFR荧光强度明显低于阴性对照组 a d A TheefficiencyofcetuximabinhibitEGFRandERK1 2phosphorylationinMCF 7 TAMRcellsweredetectedbywesternblot B IndirectimmunofluorescencestainingtodetecttheefficiencyofcetuximabinhibitEGFRandintracellularERK1 2phosphorylationinMCF 7 TAMRcells 实验结果 5 RT PCR与Westernblot显示西妥昔单抗组和PD98059组FUT4mRNA及FUT4蛋白合成均少于阴性对照组 西妥昔单抗组 b 和PD98059组中FUT4的荧光强度明显低于阴性对照组 A ThedifferenceoftheFUT4mRNAexpressioninMCF 7 TAMRcellsbeentreatedwithnonandcetuximabandERK1 2signalingpathwayinhibitorPD98059weredetectedbyRT PCR B ThedifferencesoftheFUT4proteinexpressioninnonandcetuximabandPD98059treatedMCF 7 TAMRcellsweredetectedbywesternblot C IndirectimmunofluorescencestainingwasusedtodetectthedifferencesoftheFUT4proteinexpressioninnonandcetuximabandPD98059treatedMCF 7 TAMRcells 实验结果 6 Westernblot显示西妥昔单抗和ERK通路抑制剂PD98059均可使MCF 7 TAMR细胞中LeY抗原表达水平下降 西妥昔单抗处理组 b 和PD98059组 c LeY荧光强度明显低于阴性对照组 a A ThedifferencesoftheLeYexpressioninnonandcetuximabandPD98059treatedMCF 7 TAMRcellsweredetectedbywesternblock B IndirectimmunofluorescencestainingwasusedtodetectthedifferencesoftheLeYproteinexpressioninnonandcetuximabandPD98059treatedMCF 7 TAMRcells 本研究证实他莫昔芬诱导耐药的MCF 7 TAMR细胞中EGFR和激活的p EGFR表达均增加 表明内分泌治疗与分子靶向治疗存在联系 西妥昔单抗对MCF 7 TAMR细胞增殖确有抑制作用 通过下调细胞FUT4和LeY实现的 为乳腺癌靶向治疗提供了新的靶点 也为个体化治疗用药顺序和逆转耐药提供了新的思路 结论 1 西妥昔单抗的抗肿