第五章细菌检验技术.ppt

微生物学检验 第五章细菌检验技术 本章内容 本章内容 学习目标 掌握 革兰染色的原理 操作及结果判断 细菌接种技术 培养方法 细菌在不同培养基中的生长现象 生化反应的原理 熟悉 细菌染色标本检查的基本程序 细菌培养常用培养基和器材 了解 细菌不染色标本的检查方法和用途 免疫学技术 分子生物学技术及自动化检测技术等鉴定微生物 本章重点 革兰染色的原理 操作方法及意义 细菌培养及生长现象 细菌生化反应及临床应用 第一节细菌形态检验技术 一 染色标本镜检 一 染色标本检查的一般程序 第一节细菌形态检验技术 1 单染色法细菌标本经涂片 干燥固定后 滴加染液染色1分钟 水洗后待玻片燥后即可镜检 二 常用的染色方法 第一节细菌形态检验技术 二 常用的染色方法2 革兰染色法 方法 第一节细菌形态检验技术 二 常用的染色方法2 革兰染色法 结果 紫色 革兰阳性菌 1000 红色 革兰阴性菌 1000 第一节细菌形态检验技术 二 常用的染色方法3 抗酸染色法 结果 抗酸染色结果 1000 红色为抗酸杆菌 蓝色为非抗酸杆菌 第一节细菌形态检验技术 三 其他染色法1 特殊结构染色法 1 荚膜染色法 荚膜染色结果 1000 第一节细菌形态检验技术 三 其他染色法1 特殊结构染色法 2 鞭毛染色法 鞭毛染色结果 1000 第一节细菌形态检验技术 三 其他染色法1 特殊结构染色法 3 芽孢染色法 芽孢染色结果 1000 第一节细菌形态检验技术 三 其他染色法1 特殊结构染色法 4 异染颗粒染色法 异染颗粒亚甲蓝染色结果 白喉棒状杆菌 1000 第一节细菌形态检验技术 三 其他染色法2 负染色法 墨汁荚膜染色 脑脊液中的新型隐球菌 400 第一节细菌形态检验技术 二 不染色标本镜检1 压滴法 压滴法镜检结果 尿涂片 400 第一节细菌形态检验技术 二 不染色标本镜检2 悬滴法 第一节细菌形态检验技术 二 不染色标本镜检3 毛细管法 三 其他显微镜检查 第一节细菌形态检验技术 第二节细菌接种与培养技术 一 基本条件 接种环 培养皿 红外接种灭菌器 培养箱 生物安全柜 第二节细菌接种与培养技术 一 基本条件 培养基成份 培养基 人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质 营养物质 牛肉膏 蛋白胨 肉浸液 糖醇类 血液 鸡蛋及动物血清 生长因子 无机盐等水凝固剂 琼脂 明胶抑制剂 孔雀绿 煌绿 胆盐 抗生素等指示剂 溴麝香草酚蓝 溴甲酚紫 酚红等 第二节细菌接种与培养技术 第二节细菌接种与培养技术 基础培养基 普通琼脂平板营养培养基 满足营养需求较高细菌的生长 如血琼脂平板 巧克力琼脂平板等鉴别培养基 含有某些特定的底物 用于鉴别细菌 如克氏双糖铁培养基 KIA 及各种生化反应用培养基选择培养基 具有选择性抑制非目的菌生长作用 用于选择性培养目的菌 如SS平板 中国蓝琼脂平板 伊红美蓝琼脂平板等增菌培养基 用于含菌量较少的标本 如葡萄糖肉汤 GN增菌肉汤特殊培养基 厌氧培养基 L型细菌培养基 培养基种类 按用途分 培养基 第二节细菌接种与培养技术 第二节细菌接种与培养技术 液体培养基 培养基的种类 按物理性状分类 液体培养基 不含凝固剂 用于增菌和接种纯种细菌 半固体培养基 含0 2 0 5 琼脂 用于观察细菌的动力 固体培养基 含2 3 琼脂 用于细菌的分离培养 第二节细菌接种与培养技术 第二节细菌接种与培养技术 培养基灭菌 基础培养基 121 高压蒸汽灭菌15分钟 含糖培养基 113 灭菌15分钟 含鸡蛋 血清培养基 间歇灭菌3天3次 不耐高温的液体成分 滤过除菌 调配 溶化 调Ph 过滤澄清 分装 灭菌 检定 保存 培养基制备程序 一 无菌技术 细菌检验的操作应在无菌室或生物安全柜内进行无菌室 生物安全柜使用前后均需进行消毒灭菌细菌检验使用过的物品使用前后需严格灭菌处理标本的采集严格无菌操作无菌试管 烧瓶的使用时注意管口灭菌 第二节细菌接种与培养技术 二 细菌接种与培养技术 二 细菌接种与分离技术 第二节细菌接种与培养技术 灭菌接种环 针 冷却 挑取标本 细菌 接种 灭菌接种环 针 平板划线法 分区划线 连续划线 分区划线法 第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环 第二节细菌接种与培养技术 连续划线法 第二节细菌接种与培养技术 斜面接种 半固体穿刺接种 液体接种 第二节细菌接种与培养技术 三 细菌培养方法 一般培养 需氧培养 培养需氧或兼性厌氧菌培养温度 35 37 培养时间 18 24小时二氧化碳培养法 烛缸法 二氧化碳培养箱厌氧培养法 厌氧培养箱 厌氧袋 厌氧罐 疱肉培养法 硫乙醇酸盐法等 培养厌氧菌 第二节细菌接种与培养技术 三 细菌的生长现象 第二节细菌接种与培养技术 菌落与菌苔 血平板上溶血现象 细菌在液体培养基中生长现象 第二节细菌接种与培养技术 沿穿剌线扩散生长 在穿剌线上生长 细菌在半固体培养基中的现象 一 碳水化合物的代谢试验 第三节细菌生化鉴定技术 原理 多糖 单糖 丙酮酸 酸性产物 或产气 pH 呈酸性变色 或出现气泡 方法 将待检细菌以无菌操作接种到糖发酵管中 置35 温箱培养18 24h 观察结果 1 糖 醇 苷 类发酵试验 结果 一 碳水化合物的代谢试验 第三节细菌生化鉴定技术 原理 根据细菌在分解葡萄糖的代谢过程中对氧分子需求的不同 将细菌分为氧化 发酵和产碱型三类 2 O F试验 结果 方法 取2支HL葡萄糖培养管煮沸驱氧 冷却后接种细菌 将其中一管敞开 另一管用液体石蜡封管 培养18 24h观察结果 3 甲基红试验 第三节细菌生化鉴定技术 原理 细菌发酵葡萄糖 产生丙酮酸 进一步分解生成大量混合酸 使培养pH下降至4 4以下 加入甲基红后 呈现红色反应 为甲基红试验阳性 方法 将待检菌种接种于葡萄糖蛋白胨水中 35 培养18 24小时后 往培养基中加入甲基红指示剂少许 观察结果 结果 4 V P试验 第三节细菌生化鉴定技术 原理 细菌分解葡萄糖产生丙酮酸 丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇 在碱性环境中 乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰 二乙酰与胍基化合物结合 生成红色化合物 是为V P试验阳性 方法 把待检细菌接种在葡萄糖蛋白胨水中 35 培养18 24h后 按每毫升培养液加入0 1ml含2 肌酸或肌酐的40 KOH溶液 数分钟或数小时后观察结果 结果 空白对照阴性阳性 5 半乳糖苷酶试验 ONPG 第三节细菌生化鉴定技术 原理 有的细菌可产生 半乳糖苷酶 能分解邻硝基酚 D半乳糖苷 ONPG 而生成黄色的邻硝基苯酚 该试验也称为ONPG试验 方法 将被检制成菌悬液 加入1滴甲苯充分振摇 37 水浴5分钟 使酶释放 然后再加入0 25mlONPG 混匀后 置于37 水浴中温育 菌悬液呈黄色为阳性反应 结果 阴性阳性 6 七叶苷水解试验 第三节细菌生化鉴定技术 原理 某些细菌能分解七叶苷产生葡萄糖与七叶素 七叶素与培养基中的Fe2 结合后 形成黑色的化合物 使培养基变黑 方法 将待检细菌接种到七叶苷培养基上 培养后观察结果 培养基变黑色者为阳性 培养基不变色为阴性 结果 二 蛋白质和氨基酸的代谢 第三节细菌生化鉴定技术 原理 细菌产生色氨酸酶 分解培养基中色氨酸 生成靛基质 吲哚 靛基质与对二甲基氨基苯甲醛作用 生成玫瑰靛基质 是为靛基质试验阳性 方法 将待检菌接种于蛋白胨水中 35 培养18 24h 取出后沿试管壁加入靛基质试剂数滴 在两液面观察结果 结果 1 靛基质 吲哚 试验 二 蛋白质和氨基酸的代谢 第三节细菌生化鉴定技术 原理 细菌产生酶 分解含硫氨基酸生成硫化氢 硫化氢与培养基中的亚铁盐或铅盐结合生成黑色化合物 方法 将细菌穿刺接种到醋酸铅培养基中 35 18 24h 观察结果 结果 黑色管为阳性 2 硫化氢试验 二 蛋白质和氨基酸的代谢 第三节细菌生化鉴定技术 原理 细菌产生脲酶 水解尿素生成氨和二氧化碳 培养基呈碱性反应 方法 将待检菌接种于尿素培养基中 35 培养18 24h取出观察 结果 3 尿素酶试验 二 蛋白质和氨基酸的代谢 第三节细菌生化鉴定技术 原理 细菌产生苯丙氨酸脱氨酶 使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸 苯丙酮酸与三氯化铁作用 形成绿色化合物 方法 将待检菌接种于苯丙氨酸微量培养管中 接种量稍大 培养后在培养基上直接滴加10 氯化铁试剂 出现绿色反应者为阳性 结果 4 苯丙氨酸脱氨酶试验 三 碳源利用试验 第三节细菌生化鉴定技术 原理 有的细菌能利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一的碳源 细菌在生长过程中分解枸橼酸盐产生碳酸盐 使培养基呈碱性反应 方法 将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上 培养后观察结果 培养基由淡绿色变为深蓝色者为阳性 培养基中无菌生长 仍为绿色者为阴性 结果 枸橼酸盐利用试验 四 酶类试验 第三节细菌生化鉴定技术 原理 某些细菌具有氧化酶 细胞色素氧化酶 能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺氧化生成红色的醌类化合物 方法 取洁净滤纸条 粘取被检细菌菌落 滴加氧化酶试剂1滴于菌落上 或将试剂直接滴加在被检细菌的菌落上 阳性者立即出现红色 继而变为深红色至深紫色 结果 1 氧化酶 细胞色素氧化酶 试验 四 酶类试验 第三节细菌生化鉴定技术 原理 细菌产生的触酶 过氧化氢酶 能催化过氧化氢放出初生态氧 继而形成氧分子出现气泡 方法 取待检细菌少许 置于洁净的载玻片上 滴加3 H2O2试剂1 2滴 观察结果 一分钟内产生大量气泡者为阳性 不产生气泡者为阴性 结果 2 触酶试验 四 酶类试验 第三节细菌生化鉴定技术 原理 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶 使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白 方法 于3支试管中分别加入1 4稀释的血浆0 5ml 1支管加入待检菌肉汤培养物0 5ml 另两支分别加阴阳性对照菌肉汤培养物0 5ml 35 培养3 4h后观察结果 结果 3 凝固酶试验 试管法 四 酶类试验 第三节细菌生化鉴定技术 原理 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶 使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白 方法 取未稀释的兔血浆和生理盐水各一滴分别置于载玻片的两侧 挑取金黄色葡萄球菌少许分别与它们混合 立即观察结果 细菌在生理盐水中无自凝 菌液呈均匀混浊状态凝固酶试验为阴性 菌液聚集成团块或颗粒状 则血浆凝固酶试验为阳性 结果 4 凝固酶试验 玻片法 四 酶类试验 第三节细菌生化鉴定技术 原理 某些细菌能还原培养基中的硝酸盐为亚硝酸盐 亚硝酸盐与醋酸作用 生成亚硝酸 亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮磺酸 再与 萘胺结合 生成N 萘胺偶氮苯磺酸 红色化合物 方法 将被检细菌接种于硝酸盐培养基中 35 培养18 24小时 加入甲液 对氨基苯磺酸0 8g 5mol L醋酸100ml 和乙液 萘胺0 5g 5mol L 醋酸100ml 等量混合液 观察结果 立即出现红色者为阳性 若加入试剂不出现红色 需要检查硝酸盐是否被还原 可于培养管内加入少许锌粉 如无色 说明亚硝酸盐进一步分解 硝酸盐还原试验为阳性 若加锌粉后出现红色 说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐 而待检细菌无还原硝酸盐的能力 硝酸盐还原试验为阴性 5 硝酸盐还原试验 红色为阳性无色为阴性 四 酶类试验 第三节细菌生化鉴定技术 5 硝酸盐还原试验 无色 锌粉 无色 阳性无色 锌粉 红色 阴性 结果 四 酶类试验 第三节细菌生化鉴定技术 原理 B群链球菌能产生CAMP因子 可促进金黄色葡萄球菌 溶血素活性 其他链球菌不产生CAMP因子 方法 用产生 溶血素的金黄色葡萄球菌在血平板上划种一条直线 将待检菌距金黄色葡萄球菌3mm处垂直划种一短线 用同样方法接种阴性和阳性对照菌株 35 孵育18 24h 结果 6 CAMP试验 对照 阴性 阳性 检测菌 阳性 阳性 矢状溶血 五 复合生化反应 第三节细菌生化鉴定技术 原理 KIA琼脂中含有牛肉膏 酵母浸膏 蛋白胨 乳糖 葡萄糖 枸橼酸铵铁 酚红指示剂等 乳糖的浓度为葡萄糖的10倍 若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖 培养基中的葡萄糖被分解后只能产生少量的酸 在最初培养的8 11小时内 这些酸也足以使培养基的底层和斜面变黄色 但连续培养数小时后 在细菌和氧的作用下 培养基的斜面所含氨基酸发生降解 释放氨类 立即中和斜面部分的酸 培养18 24小时后 整个斜面转变成碱性 斜面又变成红色 培养基深层中 氨基酸的降解作用不足以中和所形成的酸 故仍呈黄色 因此KIA斜面呈碱性 深层呈酸性反应 说明该菌只分解葡萄糖而不分解乳糖 若细菌分解乳糖则产生大量的酸 这些酸能中和斜面产生的碱 使整个培养基呈黄色 若细菌能分解培养基中含硫氨基酸 则可产生H2S H2S与培养基中枸橼酸铵铁起反应 产生不溶性的黑色硫化亚铁沉淀 KIA试验 六 复合生化反应 第三节细菌生化鉴定技术 方法 用接种针挑取待检细菌 先穿刺接种到KIA深层 距管底3 5mm为宜 再从深层向上提起 在斜面上由下至上划线 35 培养18 24小时 观察结果 KIA试验 常见的反应结果 斜面碱性 底层碱性 不发酵糖类 如粪产碱杆菌 斜面碱性 底层酸性 葡萄糖发酵 乳糖不发酵 如志贺菌 斜面碱性 底层酸性 黑色 葡萄糖发酵 乳糖不发酵 产生H2S 如沙门菌 普通变形杆菌 斜面酸性 底层酸性 葡萄糖和乳糖发酵 如大肠埃希菌 克雷伯菌属 肠杆菌属 六 复合生化反应 第三节细菌生化鉴定技术 KIA试验结果 第四节微生物检验的自动化和微型化 一 微生物自动培养系统 一 自动血培养检测系统基本原理 1 放射性物质标记法一般采用放射性碳14标记法 细菌生长时利用标记底物产生含14C的CO2 当14C标记的CO2量超过界限时 检测器报告阳性生长 2 二氧化碳感受器每一血液培养瓶底部都含有Novel颜色感应器 当血液培养瓶内有微生物生长释出之CO2后 感应器之酸碱值也跟着改变 从深绿色变为黄色 检测器报告阳性 3 均质荧光技术在血培养基内含有发荧光物质 微生物生长代谢过程中产生各种带电荷的原子团 培养瓶发出的荧光 即可检测有细菌存在 2 仪器的基本结构和配套试剂全自动恒温孵育系统包括恒温装置和震荡培养装置 仪器培养瓶容量常分为60瓶 120瓶 240瓶等 对培养瓶进行震荡恒温培养 温度常设为37 仪器均配置电脑 在电脑上可设置培养时间 温度等参数 显示阳性或阴性瓶所在的位置 及自动分析 3 注意事项及结果报告制度 1 培养瓶的选择如果患者未使用抗生素 可选择一般需氧菌培养瓶 如果已经使用抗生素则选用可中和血液中抗生素的培养瓶 如怀疑厌氧菌 L型菌 真菌 分枝杆感染 则选用厌氧菌培养瓶 L型菌培养瓶 真菌培养瓶 分枝杆菌培养瓶 2 采血时间对入院患者中有高热 寒战 白细胞增多或疑有感染者 最好在使用抗生素前采血送检 住院患者出现发热等败血症症状时 应及时采血 尽可能在使用抗生素前采血 已使用抗生素的患者最好在下次使用抗生素前采血 第四节微生物检验的自动化和微型化 第四节微生物检验的自动化和微型化 3 采血量采血量一般为血培养瓶中肉汤培养基量的1 4 1 5为宜 成人一般每次采集3 10ml 以8 10ml最佳 小儿一般每次采集1 3ml即可 每天最好采血2 3次 以提高检出率 并帮助判断是感染菌或污染菌 4 采血方法一般多从肘静脉采血 采集前应严格消毒采血部位 采血过程中注意无菌操作 否则易被皮肤表面细菌污染 导致假阳性 使用真空采血系统 利用配套的一次性使用的无菌采血管 血液因负压作用进入培养瓶中 5 标本送检采血后应及时送检 检验者收到血培养瓶后应尽快上机 如不能及时送检 应将血培养瓶放置室温保存 第四节微生物检验的自动化和微型化 二 自动分枝杆菌培养检测系统多数自动血培养检测系统可检测血液中的分枝杆菌 目前针对分枝杆菌有专门的自动分枝杆菌培养检测系统 可对各类标本中的分枝杆菌进行培养及检测 原理基本同自动血培养检测系统 配套专门的培养瓶 一般将各类标本直接送检 检验者收到标本后 如为清亮的穿刺液标本 可直接注入培养瓶内 放入仪器自动培养并检测 如为痰液等其他含有杂菌或细胞的标本 应先进行消化 中和等处理后再注入培养瓶 否则会导致假阳性结果 第四节微生物检验的自动化和微型化 二 微生物鉴定的自动化和微型化 一 微生物数码分类原理1 数据库由许多细菌条目组成 每个条目代表一个细菌种或一个细菌生物型 2 编码将细菌生化反应模式转换成数学模式 可把生化反应结果快速转录成数字 编码 经查阅编码检索本或电脑分析系统又可将数字转化成相应的细菌名称 3 查码在编码检索本内寻找数码信息 如菌名 鉴定结果的评价 生化结果 阳性百分率 必须增加的补充试验项目 指出注意要点等 4 解释如果一个编码只对应一种细菌 无论几率大小 为该种细菌的可能性 ID 均为99 99 如果一个编码对应两种或两种以上种类的细菌 应计算每种细菌出现的几率所占的百分比ID 如ID 99 为该种菌的可能性非常大 如ID 90 为该种菌的可能性较大 如ID 80 为该种菌的可能性也较大 但需做补充试验进一步确证 如ID 80 则一般无法准确区分菌种 必须增加多个补充试验才可得出准确结果 第四节微生物检验的自动化和微型化 第四节微生物检验的自动化和微型化 二 微生物自动鉴定仪器的基本结构和配套试剂 数码分类鉴定系统的组成由鉴定卡 添加试剂及检索工具配套形成的完整的微生物鉴定体系 1 鉴定卡常用的生化反应有 发酵试验 同化试验 同化或发酵抑制试验 酶试验 其他传统的生化反应 2 添加试剂 有些试验经孵育后需添加试剂才能呈现颜色变化 添加的试剂有配套试剂盒或单种试剂 3 检索工具 检索工具可由电脑自动处理并报告 第四节微生物检验的自动化和微型化 三 微生物药敏试验的自动化和微型化 一 原理自动化药敏试验使用药敏试验卡进