【医学课件大全】诊断酶学全套课件 (精品 165p)

泸医附院检验科吴泽才 诊断酶学 enzyme 酶的临床应用简史 1908年 测定尿液中AMY用于急性胰腺炎的诊断 30年代临床测定ALP用于骨骼疾病的诊断 1954年 证实血清AST对心肌梗死和肝脏疾患有诊断价值 60年代初 发现CK在诊断AMI方面更具特异性 70年代初 发现CK MB同工酶诊断AMI比CK特异性更高 一度被认为是 金标准 80年代以来 发现组织中同工酶进入体液后 有可能发生变化 如CK MM可进一步分为CK MM1 MM2 和MM3 CK MB可分为MB1和MB2 在诊断AMI上优于总酶和同工酶 本章主要内容 酶学基础知识血清酶酶的定量技术同工酶及其亚型测定临床常用血清酶 同工酶及其亚型 诊断酶学 探讨如何进行体液中酶 同工酶及其亚型的测定以及它们在临床诊断 疗效判断 疾病预后中的价值的问题 有关概念 酶促反应 由酶所催化的反应酶活性 activity 酶催化化学反应的能力底物 substrate 酶催化所作用的物质产物 product 酶促反应的生成物酶的特异性 specificity 酶对作用物的选择性激活剂 activator 加速酶促反应的物质抑制剂 inhibitor 减慢甚至终止酶促反应的物质 酶学基础知识 酶的分子结构与功能酶促反应的特点与机理酶促反应动力学酶的命名与分类 本节主要内容 一 酶的分子结构与功能 酶的本质 蛋白质 蛋白质 核酸 核酸 只有一条多肽链 一 酶的分子组成 完全由约100 10000个氨基酸肽键相连而成 NAD NADP 黄素腺嘌呤单核苷酸 FMN 黄素腺嘌呤二核苷酸 FAD Ca2 Mg2 Zn2 Fe2 二 酶的活性中心 二 酶促反应的特点与机理 一 酶促反应的特点 极高的催化效率 高度的特异性 酶促反应的可调节性 二 酶促反应的机理 1 酶 底物复合物的形成与诱导契合假说 2 酶促反应的机理 三 酶促反应动力学 一 酶促反应 E S ES E P K1 K 1 K2 酶 底物 酶 底物复合物 酶 产物 S P K2 E S Vmax S V dtdtKm S Km S 具体推导过程见生物化学教材Vmax 最大反应速率 S 底物浓度Km 米氏常数V 不同 S 时的反应速度 二 Km与Vmax Km Vmax V S Km V当V 0 5Vmax时 Km S Km值等于酶促反应的初速率为最大反应速率Vmax一半时的底物浓度 一般在10 6 10 2mol L之间 只与酶的性质有关 与酶的浓度无关 Km的意义 1 1 Km Km值越小 亲和力越大 2 Km值最小者为最适底物3 V Vmax S Km S 若Km和 S 已知 可计算二者比值 若二者比值已知 也可计算 S 为Km的多少倍4 计算工具酶的用量 后面将作介绍 5 鉴别酶或同工酶6 推测反应方向及效率 向Km值小的方向反应 7 寻找限速步骤 Km值最大者 Vmax的意义 Vmax定义 一定酶量下的最大反应速率 即酶完全被底物饱和时的反应速度 与酶浓度呈正比 在酶的浓度不变时 对于特定底物而言 Vmax也是一个常数 意义 Vmax Kcat E0 如果酶的总浓度已知 可从Vmax计算酶的转换数Kcat 即单位时间内每个酶分子将底物转换成产物的最大值 Kcat越大 表示酶的催化效率越高 目前已知最高酶变率的酶是碳酸酐酶 36 106min 1 Km与Vmax的测定1Km S Km11 VVmax S Vmax S Vmax以1 V为纵坐标 1 S 为横坐标作图可得一直线 纵轴截距为1 Vmax 斜率为Km Vmax 横轴截距为 1 Km 三 酶促反应的影响因素及反应条件的选择 1 底物的种类和浓度 底物种类 多底物者 酶学研究选生理性底物 一般都是Km最小者 临床测定选诊断价值高者 如ACP 前列腺癌 麝香草酚磷酸盐 专一者 据测定技术和实用两方面考虑选速度较快的正向或负向反应底物浓度 此为临床化学利用酶作为工具测定各种代谢物如Glu UA TG等的方法学基础 V Vmax K2 E 反应速率与酶浓度成正比 酶学测定时应给予充分的底物浓度 从上表可看出 底物浓度最好为Km的20倍乃至100倍 考虑到溶解度 价格等问题 一般采用10倍 具体到每一个酶应根据被测酶的底物类型和反应特异性进行选择 2 酶浓度 当 S E 时 V与 E 成正比 若 E 很高 则S被过早过多消耗 影响测定 需将E作适当稀释 3 缓冲液的种类 离子强度和pH 体液样品与底物混合后不一定维持原来的pH 会影响测定结果 应严格掌握样品与底物的用量比例 一般样品在总体积中的比例应不超过10 4 温度 25 30 37 我国推荐温度为37 5 激活剂与抑制剂 临床酶学测定中常用金属离子作为激活剂 三 酶的命名 分类与编号 习惯命名法 据酶所催化的底物 反应的性质以及酶的来源等进行命名 如乳酸脱氢酶 丙氨酸氨基转移酶 胰蛋白酶 简单但不系统 系统命名法 国际酶学委员会1961年提出 标明酶的底物与反应性质 底物名称之间以 分隔开 如L乳酸 NAD 氧化还原酶 正确合理但繁琐 酶的分类 据酶所催化反应类型将酶分为氧化还原酶 转移酶 裂解酶 异构酶 合成酶 血清酶 指存在于血清中而非血清特定产生的酶 本节主要内容 血清酶的来源去路变化的病理机制生理差异 一 血清酶的来源 血浆特异酶血浆蛋白的固有成分 在血浆中发挥特定的催化作用 eg 凝血酶原 蛋白酶类的凝血因子 纤溶酶原 ChE 铜蓝蛋白 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 脂蛋白酯酶等 大多数在肝脏合成 常作为肝功能试验的一部分 下降较有临床意义 非血浆特异酶在血浆中浓度低 且在血浆中很少发挥作用 外分泌酶 消化腺 外分泌腺 eg 胰淀粉酶 胰脂肪酶 胃蛋白酶 胰蛋白酶 前列腺酸性磷酸酶等 血中含量与相应分泌腺的功能及疾病有关 细胞酶eg ALT AST LD CK等 大多数无器官专一性 少部分有器官专一性 升高较有临床意义 临床上使用最为频繁 常用于疾病的诊断 据来源及在血浆中发挥催化功能的情况分为 二 去路 酶的清除方式与其他血浆蛋白质类似 但具体清除途径尚不十分明了 血清酶的半寿期 酶活性失活至原来一半时所需的时间称为酶的半寿期 T1 2 血清酶的失活和排泄 血管内失活 被蛋白酶降解 血清酶的半寿期与分子量 三 变化的病理机制 可能引起血清酶活性变化 升高或降低 的病理情况 细胞膜通透性增加或细胞坏死 细胞内酶合成增加 酶排泄障碍 恶性肿瘤异位分泌 酶合成障碍 中毒及遗传缺陷等 酶合成异常 酶释放增加 酶排出异常 酶合成异常 肝损害时合成酶的能力受损 凡是在肝脏合成的酶其血中浓度都有可能下降 如ChE LCAT 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 凝血酶原等 细胞对血清酶的合成增加或酶的诱导作用是血清酶活性升高的重要原因 骨骼疾病 ALP 前列腺癌 ACP 巴比妥 乙醇 哌替啶类药物 GT 酶释放增加 病因 炎症 缺血 缺氧 能源供应缺乏 坏死和创伤使细胞释放大分子量酶蛋白 影响释放的因素 细胞内外酶浓度差异 酶的相对分子量 酶的组织分布 酶在细胞内的定位和存在形式 细胞内外酶浓度的差异组织相同酶不同 内外差异不同 酶相同组织不同 差异也不同 细胞内外酶浓度相差越悬殊 血中升高的幅度可能就越大 如LD 肝内差异是3000倍 红细胞中是200倍 有人计算过 只要有1 1000肝细胞坏死 所释放的酶可使血中部分酶浓度增加一倍 轻度溶血 也可使血清中LD大幅度上升 酶的相对分子量释出速度与分子量成反比 分子量越小 血中升高的时间可能越早 如AMI时 CK 分子量85000 最先升高 而LD 分子量125000 明显推迟 酶的组织分布组织中含量越丰富 血流越丰富 胞内酶进入血流的可能性越大 由于无组织特异性 大多数血清酶不能特异地反映某个特定组织的病变 酶在细胞内的定位和存在形式线粒体酶与胞质酶比较 不易从细胞中释出 病变较轻时往往血清中浓度较胞质酶低 病变较重时可能升高幅度较大 如ALT大量存在于胞质中 而AST则在线粒体中较多 急性肝炎时 由于病变较轻 血中ALT超过AST 而在肝硬化时 主要病变为肝细胞坏死 往往AST大于ALT 有些酶与结构蛋白结合 或以多酶复合物的形式存在 较难从胞内释出 酶排出异常 AMY 升高可能是由于肾脏功能减退所引起 因AMY约有24 由肾脏排泄 ALP 胆道梗阻时升高 是因梗阻区ALP合成加强 ALP排泄受阻而逆流入血所引起 四 生理差异 性别 年龄 进食 运动 妊娠 其他情况影响参考值的制定及结果分析 性别CK ALP GT有性别差异 男性高于女性 CK肌肉组织含量高 雌激素抑制 GT合成 男性酗酒 年龄ALP在新生儿 婴幼儿 儿童 少年 青少年阶段均较成人水平高 CK LD也有类似情况 进食高脂 高糖饮食可使ALP升高 酗酒可使 GT升高 运动激烈运动CK LD AST ALD ALT均可升高 妊娠胎盘分泌 耐热ALP LD LAP 亮氨酸氨基转肽酶 ALT均有不同程度的升高 其他某些酶或同工酶有种族差异 如G6PD 美国黑人 犹太人 白人 黄种人有差异 酶的定量技术 监测方法酶活性浓度的测定连续监测法测定酶活性浓度工具酶测定条件的优化活性浓度的单位系数K值的计算与应用测定的标准化免疫化学测定法 本节主要内容 一般化学测定的原理A KC 而酶的测定 S P E 酶 Pg到ng水平 测质量困难 利用酶有加速化学反应 催化 的特性 通过测定被加速化学反应的反应速率 根据酶促反应中底物的减少量或产物的生成量来计算酶活性浓度的高低 所谓的浓度是指 酶催化活性浓度 或 酶活性浓度 酶的测定原理V P t K E或V S t K E 一 监测方法 常用的监测方法有量气法 分光光度法 荧光法 放射性核素法 电极法等 监测底物的减少量或产物的生成量 量气法 若反应系统中有气体变化 通过测量一封闭系统中气体变化后的气体体积或压力 从而计算出气体的变化量 底物的减少量或产物的生成量 只能测定产生或消耗气体的酶 操作繁琐 灵敏度低且技术要求高 很少采用 比色法和分光光度法 比色法20世纪50年代以前常用比色法 酶与底物作用一段时间后停止反应 加入化学试剂与产物或底物反应呈色 用比色计比色 作标准曲线或标准管 计算数值 分光光度法50年代起取代比色法 优点有三 一是测定范围扩大 可达红外和紫外 二是不需停止反应 三是不作标准管或标准曲线 Eg 反应系统可产生质子或电子 如脱氢酶催化的反应 可将NAD P NAD P H相互转化 利用二者吸收光谱差异可于340nm处监测底物的减少量或产物的生成量 从而推算出酶活性浓度 结合酶偶联技术 几乎可应用于各种血清酶的测定 缺点 需要精确带恒温装置的分光光度计 荧光法和放射性核素法 荧光法较分光光度法灵敏度高2 3个数量级 可用于一些低浓度酶的测定 底物或产物可产生荧光 或将荧光物质结合到底物上 根据荧光强弱的变化换算出酶的活性 核素法有污染且操作繁琐 少用 其他方法 电极法 旋光法 极谱法 高效液相色谱法或生物发光法等 二 酶活性浓度的测定 一 酶促反应进程 时间 t 零级 一级 反应级数 S P V dP dt 酶促反应时间进程曲线 S为底物 P为产物 延迟时间 监测时间 时间 底物耗尽 延滞期 线性反应期零级反应期 斜率 速度 A T 吸光度 单试剂测定体系酶促反应进程曲线 延滞期 酶促反应开始阶段 因各种因素的影响 反应速率比较慢 这段时间称为延滞期 可以是几秒到几分钟 双底物反应或需要辅酶参与者时间较长 通常为1 3min 零级反应期 经过延滞期后 在过量底物存在下 反应速率加快并达到一个反应速率稳定的阶段 即酶促反应以恒定的速率进行 不受底物浓度的影响 这段时期称为线性反应期或零级反应期 一级反应期或非线性反应期 随着时间的延长 由于种种因素 如底物因酶反应消耗而浓度下降 产物浓度上升出现逆反应 反应产物可能有抑制酶反应作用或酶的热失活等 使酶促反应减慢 即反应速率下降 偏离线性 这段时间称为一级反应期 反应速率与底物 S 成正比 产物 P 与时间t不成线性关系 若是两种或两种以上底物参与反应 则反应可为多级 统称非线性反应期 二 酶活性浓度测定方法 要求 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度 V 达到最大反应速度Vmax 即在过量底物存在下的零级反应期的速度 此时反应速度与酶浓度 E 之间有线性关系 V K E 酶与底物作用一段时间 然后加入强酸 强碱 蛋白沉淀剂等终止酶促反应 测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量 计算酶促反应的平均速度 优点 简单 不需保温设备 显色剂的选择可不考虑对酶活性的影响 缺点 无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反应 重结果不重过程 1 定时法 时间 定时法中可能引起的误差 t1 t2 1 2 3 产物生成 2 连续监测法 连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据 求出酶反应初速度 间接计算酶活性浓度的方法 优点 不需停止反应 不加呈色剂 准确监测整个反应过程 可将多点数据连接成线 很容易找到成线性的区段 可以观察到是否偏离零级反应 因而可选择线性反应期来计算酶活性 三 连续监测法测定酶活性浓度 一 连续监测法的种类直接法 在不终止酶促反应条件下 直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度 荧光 旋光性 pH 电导率 粘度等 从而计算出酶活性浓度 如 底物 E 脱氢酶 NAD P 产物 E NAD P HNAD P H在260nm和340nm处有吸收峰 而NAD P 只在260nm处有吸收峰 测定反应体系在340nm处吸光度的变化即可 间接法 底物 E产物 E 试剂 生成可被仪器检测的物质 Ei 可被检测物质 酶偶联法 血清ChE的丁酰硫代胆碱测定法 二 酶偶联反应 A B C Ex Ei A B C D Ex Ei Ea 被测定酶 始发反应 指示反应 指示酶 常为脱氢酶 辅助反应 辅助酶 多为NAD P H 内源性反应 预孵育期 延滞期 线性反应期 偏离线性 吸光度 340nm 加入试剂1 加入试剂2 时间 min 酶偶联法测定ALT的吸光度变化 预孵育期 内源性反应 去除干扰 如使试剂中的NADH变为NAD 等 始发反应是零级反应 辅助反应与指示反应必须是一级反应 辅助反应与指示反应的反应速率应超过或等于测定酶的反应速率 指示酶的选择 Km值小 酶促反应最适pH应与工具酶的反应最适pH相接近 便宜 指示酶量 Vx km x Vi Km i 测定酶的测定上限 测定酶的米氏常数 指示酶的用量 指示酶的米氏常数 Vx P km i Vi P Vi Vx 1 km i P 中间产物浓度 三 干扰因素 其他酶和物质的干扰 来自于标本 酶的污染 来自于酶制剂 非酶反应 底物分解 非酶反应产生类似产物吸收光谱的衍生物 分析容器的污染 重金属 表面活性剂 杂质等会影响酶的活性 沉淀形成解决方法作试剂空白 采用双试剂 四 工具酶 定义 通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶 一 常用工具酶及其质量要求常为氧化还原酶类 产物易监测 反应体系中的限速因子为待测化合物和待测酶 工具酶和其辅助底物应过量 工具酶纯度不必要求过高 但杂质 杂酶 抑制剂 的含量有一定限制 以减少或避免一些干扰测定的不必要的副反应 二 工具酶参与的指示反应 被测物 工具酶 氧化酶 H2O2 过氧化氢酶或POD 有色物质 葡萄糖氧化酶 尿酸氧化酶 胆固醇氧化酶 甘油氧化酶 丙酮酸氧化酶等 显色剂 氧化发色剂 邻联甲苯胺 OT 四甲基联苯胺 TMB 联苯胺 DAB 4 AAP等 偶联H2O2的工具酶及其指示反应 Glu UA 胆固醇 甘油 丙酮酸 Glu O2 H2O GOD 葡萄糖酸内酯 H2O2 4氨基安替比林 酚 POD 红色醌类化合物 Trinder反应 工具酶 脱氢酶 被测物 或被测物被催化的产物 或被测酶催化底物的产物 NAD P NAD P H NAD P H NAD P 葡萄糖 尿素 羟丁酸 TG 甲醇 血氨 ALT AST LD GLD CK ALD G6PD和ICD NAD P 或NAD P H偶联的脱氢酶及其指示反应 Glu ATP HK G6P ADP NADP G6PD 6 磷酸葡萄糖酸内酯 NADPH L 丙氨酸 酮戊二酸 ALT L 谷氨酸 L 丙酮酸 H NADH LD L 乳酸 NAD 被测酶 五 血清酶活性浓度测定条件的优化 理想状况是达到 最适条件 即在所选温度下使酶促反应的催化活性达到最大 影响因素 底物 辅因子 激活剂 缓冲液和变构剂种类和浓度 指示酶和辅助酶的种类和浓度 反应混合液的pH和离子强度 其他可变因素 如已知抑制剂的去除 最适条件 虽能提高准确度 但往往很难重复 若测定的准确性和重复性二者均需兼顾 可考虑对最适条件进行适当修改 主要包括以下内容 1 方法选择多用连续监测法 少用或不用定时法 少步骤 2 仪器和设备性能必须符合要求 检测装置必须清洁干净 3 试剂符合要求 尽量用液体双试剂 4 自动生物化学分析仪参数的设置据仪器及试剂给出的方法和参数进行设置 认真自学 5 标本的采集 运输与保存的技术误差因素 见链接 六 酶活性浓度的单位 一 酶活性单位惯用单位谁先报告测定方法 即以他的名字命名 如转氨酶的Karmen单位 King单位 ALP的King单位等 混乱 无可比性 国际单位 见链接 Katal单位 见链接 二 酶活性浓度单位表示方法U L1U L 16 67nKata L酶活性浓度单位的计算标准管法 标准曲线法 摩尔消光系数法摩尔消光系数 在特定条件下 一定波长的光 光径为1 00cm时 通过所含吸光物质的浓度为1 00mol L时的吸光度 U L A min V 106 v L 吸光度变化 反应体系体积 ml 摩尔消光系数 cm2 mol 1 样品量 ml 比色杯光径 cm 将mol换算成 mol 三 参考值和正常上限倍数的应用因仪器 试剂 方法不同 各实验室应建立自己的参考值 正常上限 ULN 倍数 测定值 正常上限值 七 系数K值的计算与应用 U L A min K K V 106 v L 酶活性浓度定量系数 如连续监测法测定血清中LD活性浓度 已知 为6 22 103cm2 mol 1 血清量为50 l 底物液为1ml 比色杯光径为1cm 则K 1 05 106 6 22 103 0 05 1 3376 一 系数K值的意义与设置K值大 线性宽 但重复性差 K值小 线性窄 精密度好 K值设置应兼顾参考上限与测定时间 上限大 测定时间长 则K值大 上限小 测定时间短 则K值小 仪器噪音 仪器对同一溶液反复测定时的吸光度误差 一般只能控制在0 001水平 若K为8000 测定时间为1min 则误差为8U L 测定时间为2min 误差为4U L 测定时间为0 5min 误差为16U L 改变K值最简章的方法就是改变标本的稀释度 稀释倍数越大 K值越大 标本加样体积v V 二 系数K值的类型与计算理论K值 由理论 值计算得出仪器实测K值 U L标 A标 min K 校正品已给出数值 仪器可测出 标准化途径 使用推荐方法或参考方法 使用公认的酶校正物或酶参考物 全球参比体系 八 临床酶学测定的标准化 九 酶的免疫化学测定 利用酶蛋白的抗原性 通过抗原抗体反应直接测定酶的浓度 活性浓度或质量浓度 方法放射免疫测定 RIA 免疫抑制法 化学发光免疫测定 CLIA 酶免疫测定 EIA 荧光酶免疫测定 FELA 一 测定原理总的来说 就是利用抗原抗体反应进行测定 具体到不同的方法 又有所差异 以RIA为例直接法 核素标记物 待测酶 产生沉淀 沉淀定量分析间接法 待测酶与标记酶竞争有限抗体 据竞争程度来定量样品中的酶蛋白量 报告方式 活性单位U L 质量单位ng ml或 g L 二 免疫化学测定的优缺点优点 灵敏度高 特异性强 能用于一些不表现酶活性或无活性的酶测定 特别适用于同工酶的测定 缺点 试剂制备困难 操作繁琐 成本高 同工酶及其亚型测定 isoenzyme 同工酶 同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体 纯聚体或杂合体 具有相同的催化功能 但其分子组成 空间构象 理化性质 生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶 亚型 指基因在编码过程中 由于翻译后修饰差异所形成的多种形式的一类酶 往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶的降解作用而形成 人体中几种重要的同工酶 一 分类 单基因决定的同工酶复等位基因同工酶多基因决定的同工酶修饰的同工酶 二 分析方法 理论基础 同工酶及其亚型的一级结构不同 导致其在理化性质 催化活性 生物学性质等方面有明显的性质差异 利用这些差异进行分析 分析步骤 先分离再测定常用方法 电泳法 色谱法 免疫分析法 免疫抑制法 免疫化学测定法 RIA EIA FIA CLIA 动力学分析法 蛋白酶水解法 1 电泳法 方法 醋纤膜电泳 以往多用 琼脂糖凝胶电泳 日前国内外的一些自动化电泳分析系统多采用琼脂糖凝胶作支持介质 采用高压电泳进行同工酶及其亚型的分离与鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 毛细管电泳 显色染料 偶氮染料和四唑盐扫描定量 显色后的区带用光密度计或荧光计扫描定量分析 巨分子酶若区带数与同工酶数不一致时 应特别注意巨分子酶的存在 其形成原因主要有 酶与免疫球蛋白形成的复合物 如CK BB IgG CK MM IgA LD IgA等 酶与其他蛋白质形成的复合物 如LD 脂蛋白等 酶亚基或酶分子之间形成的聚合物 如CK Mt聚合物 LD亚基自身聚合等 现已有关于CK LD AST AMY GT和ALP等巨分子酶的报道 如患者临床症状不典型 同工酶谱异常时要特别警惕血清中有无巨分子酶 以免造成对酶测定结果的错误判断和临床误诊 用免疫抑制法测定CK MB时 如出现CK MB高于总CK的现象时 就要怀疑有巨CK的存在 可用电泳法 热失活法 免疫学方法进行鉴定 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 正常 急性心肌梗死 慢性肝炎 溶血性贫血 正常和几种病理状况时血清LD同工酶的琼脂糖凝胶电泳分离图谱 MM3 MM2 MM1 CK MM MB2 MB1 CK MB CK BB 阴极 阳极 巨CK2 腺苷酸激酶 AK 巨CK1 CK BB IgG 巨CK1 CK BB IgA 清蛋白复合物 CK MT 清蛋白与内源性荧光物质形成的复合物 A B A典型CK同工酶与亚型区带 B异常CK区带 正常和病理状况时琼脂糖凝胶电泳分析血清CK同工酶可能出现的酶带 2 色谱法3 免疫分析法免疫抑制法利用同工酶的一种亚基与相应的抗体结合后 酶活性受到抑制 测定加与不加抗体前后样品中酶活性变化 可以计算出该型同工酶的活性 M M M B B B CK MM CK3 CK MB CK2 CK BB CK1 若亚基M与相应抗体结合 酶活性受到抑制 CK MM将被完全抑制 CK MB被抑制50 而CK BB则不受影响 当血清中无CK BB或仅有痕量时 则 不加抗CK MM血清时样品的CK活性 CK MM和CK MB活性加入抗CK MM血清时样品的CK活性 50 CK MB的活性加入抗CK MM血清时样品的CK活性 2 CK MB活性所测CK MM和CK MB之总活性 CK MB活性 CK MM活性 免疫沉淀法加入抗体前测得的总活性 上清液酶活性 被沉淀的同工酶的活性前列腺ACP PAP 胎盘ALP的测定 其他免疫学方法测定酶蛋白均是测质量 4 动力学分析法5 蛋白酶水解法 临床常用血清酶 同工酶及其亚型分析 转氨酶及其同工酶 谷氨酰转移酶及其同工酶肌酸激酶及其同工酶和亚型乳酸脱氢酶及其同工酶碱性磷酸酶及其同工酶酸性磷酸酶及其同工酶淀粉酶及其同工酶脂肪酶胆碱酯酶 酶浓度变化的病理机制及其病因推断 由细胞坏死或细胞膜通透性变化引起 表示脏器或组织损伤 细胞内酶合成增加所致 提示组织再生 修复 成骨或异位分泌 或提示有恶性肿瘤的可能 酶排泄障碍引起者说明有梗阻存在 同工酶的分析与鉴定则更能反映疾病的部位 性质和程度 一 转氨酶及其同工酶 转氨酶 氨基转移酶 催化氨基在氨基酸与 酮酸间转移的酶类 体内有60多种 丙氨酸氨基转移酶 ALT 天 门冬氨酸氨基转移酶 AST 是最重要的两种 一 生物化学特征 L 丙氨酸 酮戊二酸 ALT L 谷氨酸 L 丙酮酸 H NADH LD L 乳酸 NAD 二 测定方法 L 门冬氨酸 酮戊二酸 AST 草酰乙酸 L 谷氨酸 H NADH MD L 苹果酸 NAD 二反应中 NADH的氧化速率与标本中的AST和ALT活性呈正比 在340nm处检测吸光度的下降速率 根据线性反应期吸光度下降速率 A min 计算出AST ALT的活性浓度 三 临床意义 ALT反映肝损害的一个很灵敏的指标 临床上主要用于肝脏疾病的诊断 ALT主要存在于胞质中 正常情况下肝细胞中ALT浓度约为血清中的7000倍 1 1000肝损害可使血清中ALT升高1倍 反映急性肝损害急性病毒性肝炎 药物或酒精中毒 ALT很快升高 峰值可为20ULN甚至100ULN以上 判断病情ALT水平与急性肝炎病情轻重相平行 最先升高最后降至正常 可用它判断肝炎是否恢复 鉴别诊断肝脏疾病AST ALT 急性肝炎时 1 肝硬化时 2 肝癌时 3 注意酶胆分离重症肝炎时由于大量肝细胞坏死 血中ALT逐渐下降 而胆红素却进行性上升 出现所谓 酶胆分离 现象 常是肝坏死的前兆 其他疾病心脏 骨骼肌受损 胆石症 胆囊炎 肝癌 肝淤血 药物等可引起血中ALT升高 很少超过10ULN AST心肌含量最高 以往多用于AMI的诊断 但由于它升高迟于CK 恢复早于LD 故诊断AMI价值不大 现少用 肝中含量约为ALT的2 5倍 主要存在于线粒体中 急性肝炎时升高程度不及ALT 慢性肝炎 特别是肝硬化时 病变累及线粒体 AST升高程度超过ALT ALT AST轻度增高 1 3ULN 胰腺炎 乙醇性脂肪肝 肝硬化 肉芽肿 肿瘤 中度增高 3 10ULN 传淋 慢活肝 肝外胆道梗阻 心肌梗死 重度增高 20ULN 病毒性肝炎 中毒性肝炎等 AST ALT 肝硬化 慢活肝 心肌梗死 二 谷氨酰转移酶及其同工酶 催化 谷氨酰基从谷胱甘肽 GSH 或其他含 谷氨酰基物质中转移到另一肽或氨基酸分子上 含SH基的糖蛋白 底物特异性较差 一 生物化学特征 二 测定方法 L 谷氨酰 3 羧基 对硝基苯胺 甘氨酰甘氨酸 GT pH7 4 2 硝基 5 氨基苯甲酸 谷氨酰双甘肽 黄色物质 410nm处直接连续监测 吸光度的增高速率与 GT活性成正比关系 三 临床意义 三 肌酸激酶及其同工酶 一 生物化学特征 二 测定方法 磷酸肌酸 ADP CK pH6 5 肌酸 ATP 葡萄糖 HK 6 磷酸葡萄糖 ADP NADP G6PD 6 磷酸葡萄糖酸盐 NADPH H 340nm处测定NADPH生成速率而计算CK活性浓度 CK同工酶测定多用电泳法和免疫抑制法 现条件好的地方采用免疫化学方法测CK MB的质量 CK同工酶亚型多用琼脂糖凝胶高压电泳或等电聚焦电泳 三 临床意义 CK CK同工酶 心肌 骨骼肌 脑疾患的诊断和鉴别诊断及预后判断 AMI在梗死后3 8h即升高 10 24h达峰值 3 4d恢复正常 全身性疾病 如肌肉疾病 时可引起CK的极度升高 3000U L 心肌炎 皮肌炎时可升高 但神经疾病引起的肌萎缩时CK一般正常 新生儿窒息 脑梗塞等引起脑组织损伤时可见升高 同工酶亚型 对早期AMI的检出较同工酶更为敏感 但由于分析方法的准确性稍差 且诊断AMI有更好的标志物如肌钙蛋白等 使用受到限制 四 乳酸脱氢酶及其同工酶 L 乳酸 NAD pH8 8 9 8 pH7 4 7 8 丙酮酸 NADH H 一 生物化学特征 羟丁酸脱氢酶 HBD LD是由M和H两种理化性质 催化功能和免疫反应性均不同的亚基按不同比例组成的四聚体 不同方法测出LD结果差异很大 HBD是用 羟丁酸作底物 测定LD中H亚基的活性 主要为LD1和LD2之和 由于是催化 羟丁酸脱氢 故称为 羟丁酸脱氢酶 用 羟丁酸作底物测定的 HBD活性并不等于以乳酸为底物测定的LD1和LD2活性之和 HBD并不是一种独特的酶 而是LD的H亚基作用于另一底物的反映 以心 肾和红细胞的含量最高 二 测定方法 L 乳酸 NAD pH8 8 9 8 pH7 4 7 8 丙酮酸 NADH H 以丙酮酸为底物 反应方向P L 为逆向反应 称LD P法 以乳酸为底物 反应方向L P 为正向反应 称LD L法 逆向速率比正向快 但由于NAD 价格明显低于NADH 我同多采用LD L法 LD同工酶多采用电泳法 免疫沉淀法 免疫抑制法 以琼脂糖凝胶电泳最常用 成人 LD2 LD1 LD3 LD4 LD5 部分儿童 LD1 LD2 三 临床意义总酶活性 同工酶 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 正常 急性心肌梗死 慢性肝炎 溶血性贫血 正常和几种病理状况时血清LD同工酶的琼脂糖凝胶电泳分离图谱 五 碱性磷酸酶及其同工酶 在碱性环境 最适pH为10左右 水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物 一 生物化学特征 血清中ALP主要来自肝脏和骨骼 生长期儿童血清内ALP大多数来自成骨母细胞和骨软骨细胞 少量来自肝 二 测定方法 磷酸苯二钠法以前多用无色的磷酸对硝基酚 4 NPP 在碱性溶液中被ALP作用后生成对硝基苯酚 对硝基苯酚在碱性环境中变成醌式结构而呈黄色 于405nm处连续监测吸光度增高速率即可计算出ALP活性 三 临床意义 生理性增高骨生长 妊娠 成长 成熟 脂肪餐 病理情况主要用于骨骼 肝胆系统疾病的诊断和鉴别诊断 尤其是黄疸的鉴别诊断 急性肝炎 ALP轻度升高2 5ULN 肝硬化 胆石症和肿瘤引起的胆汁淤积 ALP达5 20ULN 肝外胆道阻塞ALP升高程度与阻塞程度及病程成正比 阻塞引起的ALP升高 主要是胆汁ALP 伴有肝ALP 而肝病引起的ALP升高 则主要是肝ALP 各种骨疾病及恶性肿瘤骨转移 维D缺乏症等均可引起ALP升高 主要为骨ALP 六 酸性磷酸酶及其同工酶 作用类似于ALP的磷酸酶 最适pH在7 0以下 一 生物化学特征 二 测定方法 测活性方法与ALP类似目前多用免疫学方法测PAP 三 临床意义 主要用于前列腺癌的诊断 目前正被肿瘤标志物前列腺特异性抗原 PSA 所取代 七 淀粉酶及其同工酶 水解淀粉 肝糖原等多糖化合物为糊精 麦芽糖和少量葡萄糖的一组酶 人和动物只含 淀粉酶 血浆非特异酶中的外分泌酶 胰泡细胞 唾液腺分泌 需钙的金属酶 不宜用去钙血浆测定AMY 分子量小 易由肾脏排出 半寿期很短 约2h 病变时血清AMY增高持续时间很短 一 生物化学特征 二 测定方法 4NP G7 AMY 4NP G4 3 2 G5 4 3 葡萄糖苷酶 4NP G4 G 4NP 对硝基苯麦芽庚糖苷 对硝基酚 黄色 405nm处连续监测吸光度的上升即可计算出AMY的活性 葡萄糖 三 临床意义 胰腺炎的诊断急性胰腺炎发病后2 3h血AMY开始升高 12 24h达峰值 2 5d降至正常 持续升高表示病情反复或有并发症 尿AMY于发病后12 24h开始升高 下降比血清AMY慢 在急性胰腺炎后期测定尿AMY更有价值 诊断胰腺炎时 应注意AMY增高幅度与病情不成比例 如原AMY已升高却发生与症状不相应的降低时 应警惕胰腺坏死 八 脂肪酶 LPS 又称三脂酰甘油脂酰水解酶或甘油三酯酶 胰腺外分泌酶 测定方法 测产物增加 测底物减少 测LPS的实际质量 比浊法橄榄油为底物 400nm处比浊或340nm处连续监测浊度变化 影响因素多 分光光度法酶偶联显色比色法 人工合成底物连续监测法 灵敏度 特异性均较高 抗干扰强 临床意义 用于急性胰腺炎的诊断 较AMY上升的时间早 上升的幅度大 持续的时间长 诊断价值优于AMY 但由于测定方法比AMY复杂 结果可靠性较差 在临床应用方面不如AMY 九 胆碱酯酶 ChE 是一类催化酰基胆碱水解的酶类 又称酰基胆碱水解酶 人体主要有两种 即乙酰胆碱酯酶 AChE 又称真性胆碱酯酶或胆碱酯酶 丁酰胆碱酯酶 BuChE 又称假性胆碱酯酶或拟乙酰胆碱酯 PChE 或胆碱酯酶 临床常规检查的胆碱酯酶 SChE 即指后者 通常简称为ChE AChE主要分布于神经组织 肌肉 红细胞 肺等处 其生理功能是催化水解乙酰胆碱 能使神经细胞反复除极 ChE BuChE主要在肝脏合成 生理功能至今尚未阐明 测定方法 丁酰硫代胆碱 H2O ChE 丁酸 硫代胆碱 5 5 巯代 2 硝基苯甲酸 5 巯基 2 硝基苯甲酸 黄色 于405nm处连续监测吸光度的上升值 即可计算出血清ChE的活性 临床意义 评价肝脏合成功能各种慢性肝病