【医学ppt课件】男性不育的实验室诊断及评估(55p)

男性不育的实验室诊断及评估 南京医科大学生殖医学重点实验室周作民 维持男性生育的基本条件 1 睾丸内产生足够数量的精子 2 精子在男性生殖管道内获得运动能力和受精能力 既精子的成熟 3 输精管道通畅 4 具有正常的性功能 5 附属性腺功能正常 不育症诊断的步骤 1 病史采集 包括年龄 职业 生育史 疾病史 家族史等 2 体格检查 包括外生殖器和全身体检 3 实验室诊断4 特殊检查 一 精液常规分析 精子 5 精液组成 精囊腺液 60 凝固因子 果糖 精浆 95 前列腺液 20 液化因子 尿道球腺液 3 睾丸液 附睾液 精子 精液分段成分 前段 睾丸液 附睾液 精子 尿道球腺液中段 前列腺液后段 精囊腺液 精液变量的参考值 精液量 2 6ml颜色 灰白液化时间 60 活力 A B 50 或A 25 精子计数 2000万 ml畸形率 30 脓细胞 5个 HP 1 106 ml 精子活力分级A级 快速前向运动B级 慢或呆滞的前向运动C级 非前向运动D级 不动 影响精液常规数据准确性的因素 自身的波动性 要求首次检查应连续进行两次 间隔时间7天 3周 两次结果差异大时应再检一次 每周测定一次精子密度 连续120周 期间此人未服药 也无发热 结果显示精子密度可有显著性波动 禁欲时间 要求2 天 采精方式 要求用手淫法或取精器取精 盛精容器 要求用对精子无毒性的玻璃或塑料容器 室温 要求不低于20度 观察时间 要求精液液化后 取精后1小时内检测 检测设备 冬天检测应注意保温 精液常规异常的分析 1 精液量异常1 无精液症 精液量6ml病因 附属性腺感染 附属性腺功能亢进 2 精液液化及粘稠度异常 精液不凝固或凝固不全 精液稀薄 流动性大 病因 精囊腺炎症 精液不液化或液化不全 液化时间 30分病因 前列腺功能障碍 3 精液pH异常 测量方法 pH试纸 pH范围6 1 10 0或6 4 8 0 pH过低 pH 7 2原因 输精管和精囊腺的缺如 附睾病变 pH过高 原因 精囊腺液分泌过多 前列腺液分泌过少 4 精子记数异常 正常 20 106个 ml测定方法 血球计数板 一次性精子计数板 Makler精子计数板 CASA仪1 少精子症 250 106个 ml 5 精子畸形 观察方法 吉姆萨染色法或瑞士染色法 巴氏染色法 布赖恩 利什曼染色 肖尔染色法畸形分类 头部畸形 大头 小头 锥形头 梨形头 无定形头 空泡样头 双头等 颈和中段畸形 缺尾 弯曲尾 肿胀 过薄等 尾部畸形 短尾 多尾 断尾 卷尾 双尾等 胞质残余体 常位于精子颈部 白细胞检查 正甲苯胺蓝过氧化酶染色法 结果 白细胞染成棕红色 联苯胺法 染料 联苯胺 玫瑰红结果 白细胞 褐色 其它细胞 品红色 二 精子运动特性的检测和分析1 显微镜观察 注意事项 1 取精液10ul 滴于玻片 盖上22 22盖玻片 静置1分钟后观察 2 控制温度 最好在37 进行 3 每次观察4 6个视野 计算100个细胞 计算A级 B级 C级和D级精子的百分比 连续观察两张滴片 误差不得 10 2 多点曝光技术 在1秒钟内对精子连续曝光6次 可判断精子的运动速度及运动轨迹 精子运动速度分布 快速 25微米 秒中速 10 25微米 秒慢速 10微米 秒 3 计算机辅助的精子分析系统 CASA 原理 用高分辨率摄像机实时记录精子及精子运动图象 用分析软件对图象进行处理和分析 并得出结果 硬件 显微镜 摄像机 微机软件 图象分析系统 参数及意义 1 运动精子密度 活动率 前向运动率2 活力参数 平均路径速度 曲线速度 直线速度 不足之处 价格高 误判多 特别是脱落细胞多时 不能识别畸形精子 脓细胞 对待检标本的精子密度有一定要求 精子数量少时 计数偏高 精子数量高时 活率偏高 宫颈粘液穿透试验 1 体内试验 性交后试验 PCT 注意事项 排卵期进行 禁欲至少2天 最好在性交后9 24小时进行观察 诊断标准 正常为宫颈粘液中的活动精子数 50个 HP或A级精子 20个 HP 影响因素 女方的内分泌状况 宫颈粘液中的白细胞 阴道pH 8 5可导致PCT异常 宫颈结构异常 抗精子抗体影响 性功能异常 如阴道痉挛 精子质量差 2 体外试验 玻片试验 精子 宫颈粘液接触试验 毛细管试验 穿透介质 人宫颈粘液 宫颈粘液代用品 牛宫颈粘液 含人血清精子营养液 含牛血清白蛋白精子营养液 鲜鸡蛋清 精子顶体酶测定 明胶膜法 1 制备5 明胶溶液 吸取100ul均匀涂于载玻片上 自然干燥 4 湿盒备用 使用前用甲醛 酒精固定液固定60分钟 2 精子处理 取液化精液 用PBS稀释至2 4 106个 ml 3 涂片 取1滴精液涂于明胶膜上 37 湿盒2小时 4 观察 于相差显微镜下计数有反应精子的百分率及精子的平均反应直径 5 正常值 平均反应率 65 平均反应直径 25 m 6 去透明带仓鼠卵穿透试验1 精子准备 精液充分液化 调整精子浓度至10 106个 ml 精子获能 取精液0 5ml 5 CO2 95 空气中 37 孵育18 24小时 调整精子浓度至4 106 ml 2 卵细胞准备 取动情第一天仓鼠 腹腔内注射PMSG30 40U 48 72小时后再次注射HCG30 40U 18小时后输卵管内取卵 1 透明质酸去除卵丘细胞 0 1 胰蛋白酶去除透明带 3 体外受精 将0 1ml精液加至液体石蜡下 再加入20 30个仓鼠卵 培养3小时 4 结果观察 相差镜下见卵丘细胞内膨大的精子头为受精卵 计算受精率 正常为 10 三 精液生化指标检测1 酸性磷酸酶测定 ACP 原理 P 硝基酚磷酸二钠ACP P 硝基酚测定产生的P 硝基酚含量 推测ACP的活性正常值 200U 一次射精意义 反映前列腺功能 2 果糖测定 间苯二酚法原理 果糖 间苯二酚加热 红色化合物测定化合物含量正常值 0 87 3 95g L意义 反映精囊腺功能与精子供能有关3 糖苷酶测定原理 麦芽糖 糖苷酶 葡萄糖测定葡萄糖含量正常值 35 1 87 7U ml意义 反映附睾功能 四 抗精子抗体测定1 常用方法 1 凝集试验 原理 大分子或多价抗体如IgM或分泌型IgA可以在精子间形成交链 产生精子凝集 观察 试管 玻片凝集试验 FramRlin Dukes 将待检样本与液化的精液混合后 于 孵育 小时 显微镜下观察 出现 条以上精子头 头 尾 尾或头 尾连接即为凝集 观察 个视野 个以上出现凝集即为阳性 圆盘凝集试验 Friberg 凝胶凝集试验 Kibrick 缺点 假阳性高 2 精子制动试验 Isojima 原理 在补体参与下 精子表面的抗精子抗体可抑制精子的运动能力 缺点 敏感性差 IgA的作用常测不出 吸附于精子头部的AsAb作用也常常测不出 3 直接免疫荧光试验 原理 用荧光素标记抗人免疫球蛋白抗体与精子混合后 如精子表面有抗体 则标记的二抗吸附于精子表面 出现荧光 优缺点 方法敏感 假阴性少 且可确定吸附部位 但假阳性多 4 免疫珠试验 原理 将聚丙烯珠与兔抗人免疫球蛋白相连 如精子表面有抗精子抗体 则免疫珠与精子表面吸附 光镜下即可观察到 计数吸附在免疫珠上的活动精子数 计算百分比 且可确定吸附部位 优缺点 结果可靠 且可进行抗体分类和定位 但价格较贵 5 混合抗球蛋白抗体试验 MAR试验 原理 将精液与包被了IgG或IgA的乳胶颗粒或红细胞混合 在加入二抗 颗粒与活动精子间形成混合凝集预示精子表面存在IgG或IgA 6 酶联免疫吸附试验 ELISA 原理 将精子抗原吸附于酶标板上 加入待检样本 如有AsAb则吸附于精子抗原上 加入酶标二抗 与AsAb结合 最后加入底物 产生颜色反应 优缺点 可大规模使用 但有假阳性和假阴性 必须设定阳 阴性对照 五 激素测定六 遗传检测 一 染色体检查 染色体的非整倍体 性染色体的非整倍体精子发生需要性染色体的平衡 即一个X和一个Y X或Y的数目异常均可导致精子发生异常 1 47 XXY男性 Klinefelter ssyndrome 发生率1 500 睾丸发育不良 精子发生障碍 46 XY 47 XXY亦经常发生 伴有无精子或少精子 2 48 XXXY 49 XXXXY表型为女性 阴茎发育不良 隐睾 3 46 XX男性 由于Y染色体的短臂 Yp11 异位到X染色体的短臂上 Xp22 内生殖器表现型取决于Yp11的断裂部位 Yp11远端 SRY附近 的断裂常导致隐睾 小阴茎 尿道下裂 4 45 X男性 较少见 为Y长臂缺失 短臂异位至常染色体上 13 15 22常见 5 47 XYY发生率1 750 活检显示曲精小管受损 生精阻滞于精母细胞阶段 有时有精子生成 少数人能生育 但胚胎易死亡 或后代有异常染色体 45 75 精母细胞带有二个Y 6 Y A平衡异位 Y长臂远端的异染区 Yq12 转移至端着丝粒常染色体的长臂上 Y长臂断裂在Yq11上 断裂部位对精子发生的影响较大 距Yq11较近时 精子发生基因受损 致精子发生障碍 断裂距Yq11较远时 精子发生可正常并能生育 但带有Y A异位的很易再断裂而引起不育 或将异位传给子代 使子代发生断裂而导致精子生成障碍 2 常染色体的非整倍体在不育男子中 常染色体结构异常的发生率是有生育能力男子的10倍 1 男性Turner氏综合征 Noonan综合症 为常染色体显性或隐性遗传病 染色体核型常为46 XY 或XO XY嵌合体 临床表现 身体矮小 颈蹼 典型的脸部特征 心脏缺陷 隐睾 无精子或少精子症 血睾酮下降 FSH和LH升高 21三体 Down综合症 可生育或不育 多余的一条21可影响联会复合体的形成 也可影响性染色体上性泡 Sexvesicle 的形成 3 9 10染色体长臂的部分三体或单体可引起性翻转 性腺退化 生精障碍 罗伯逊异位 无精子症患者可见 但常引起严重少精子症 体细胞和生精细胞内的染色体异常可能不一致 已发现1号染色体的非整倍体和XY精子的发生率是体细胞的10倍 如用XY精子行ICSI则可产生47 XXY的后代 已有报道 ICSI的胚胎性染色体非整倍体的发生率高于自然生殖 因此对行ICSI的患者 最好进行精子的染色体分析或植入前胚胎的遗传分析 二 精子发生基因 Azoospermiafactor AZF 检测1 AZF存在部位 Yq11 232 AZF的重要候选成分 YRRM1 DYS240 DAZ3 AZF与精子发生的关系 精子发生障碍患者中 无精子或精子计数小于500万 ml 约有 有AZF缺失 4 AZF的检测方法 1 染色体原位杂交法 2 Sout