分枝杆菌电转化方案.doc

分枝杆菌电转化分为慢速生长型分枝杆菌(如Tice BCG/M. M/H37Ra/H37Rv菌等)及快速生长型分枝杆菌(如M.smegmatice菌等)。Scheme：慢速生长型分枝杆菌电转程序：注意：也可以采用菌落转化：取新鲜的菌落，约两满板，刮到含有玻璃珠的50ml离心管，要充分打碎，打散！剧烈震荡至少5X5min。然后用10%甘油洗涤3遍，其余同下面的转化。 1. 需要准备的材料：1) 10% 甘油+0.05% Tween 80 20ml 甘油+180毫升水+100ul Tween 80，并用0.2m滤器过滤。要求新鲜配制，不得超过1周2) 灭菌的玻璃珠，50ml离心管，Bio-rad 于0.2cm的电转杯，25-ml移液管。3) 50ml长好的对数期的菌液菌液的OD值，达到0.5-1.0。带滤芯的1ml枪尖。2. 程序：1) 将待转菌接种至含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，37度摇菌扩增（对M. marinum， M. ulcerans是 28-30度）。冻存甘油菌需要先加到含有5ml培养基的50ml 离心管复壮，待长起之后，需取2ml，接种到含含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中；菌落需取很多加入含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，同时锥形瓶中需加入10颗左右的玻璃珠；普通生长的或在4度保存的菌，接种时可以取5至10ml加入含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中。2) 检测菌液的OD值，若达到0.5-1.2，则可进行电转化。3) 配制10% 甘油+0.05% Tween 80并用0.2m滤器过滤。4) 将40ml菌液转至50 mL离心管中，加入1013颗玻璃珠后，于涡旋器中充分涡旋5分钟后目的是将菌团块打散，于离心机中4000-8000rpm离心5分钟。弃上清千万小心，菌块很容易脱落。5) 加入40mL 10%甘油，于涡旋器中充分洗涤细菌后，于离心机中以4000-8000rpm离心5分钟，弃上清千万小心，菌块很容易脱落。6) 重复步骤5）1-2次后，留约1 mL上清视菌浓度而定，一般较稠，似大肠杆菌感受态细胞密度，用带滤芯的枪尖，吹吸均匀后，室温静置。千万注意：枪杆不要碰到管壁。7) 于标记好的0.2cm的电转杯中，分别加入10 L 浓缩后的质粒DNA 和200 L分枝杆菌感受态细胞。轻柔吹吸混匀后，于37度孵育至少10分钟，以利DNA吸附于细菌。8) 用Bio-rad GenePulser点转移，以电压2.5KV、电阻1000 、电容25F脉冲波进行电转化。未加DNA的细菌阴性对照的脉冲时间应于1921秒间，该时间范围显示待转细菌处于良好状态。若感受态细胞洗得不干净或质粒含盐较多，会发生爆炸，不过很多情况下，爆炸后的也可以长出阳性克隆。 未发生爆炸的电转杯灭菌后仍然可用。9) 迅速用带滤芯的枪尖于电转液中加入2 mL 7H9(含吐温80)培养基(先用1 mL转移电转液，再用1 mL洗涤电转杯)，转移至50mL离心管中。千万注意：枪杆不要碰到管壁。 10) 于37度孵箱中孵育1220小时，充分复活细菌并使其抗性表达。11) 用带滤芯的枪尖吹吸混匀后，1ml/1.5ml tube 分装，10000 rpm离心1分钟沉淀转化菌，弃上清，用0.6 mL 7H9培养基重悬后，以500 L/板铺于7H11(含4-anti*及相应抗生素)培养板中。同时稀释一百倍后，500 L/板铺板。 可以尝试 制备的感受态于-80保存，过几周后进行转化实验12) 避光，于37度孵箱培养培养时，2个平板放在一个塑料袋中。避免多个放在一起，造成连环污染。 13) 每周观察污染情况，第一周后，平板倒置。观察时，不要打开塑料袋。第4周可以判断转化是否成功。 注意：离心要配平。 备注1:4-anti抗生素:多粘菌素B、放线菌酮、羧苄西林及甲氧苄啶，终浓度分别为200、50、50及20g/mL)。 培养BCG，H37Rv and H37Ra 的7H9 可以加:4-anti抗生素。快速生长型电转程序：1. 需要准备的材料：1) 10% 甘油+0.05% Tween 80 20ml 甘油+180毫升水+100ul Tween 80，并用0.2m滤器过滤。要求新鲜配制，不得超过1周2) 灭菌的玻璃珠，50ml离心管，Bio-rad 于0.2cm的电转杯，25-ml移液管。3) 50ml长好的对数期的菌液菌液的OD值，达到0.6-1.3。带滤芯的1ml枪尖。3. 程序：1) 将待转菌接种至含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，37度摇菌扩增。冻存甘油菌需要先加到含有5ml培养基的50ml 离心管复壮，待长起之后，需取2ml，接种到含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中；菌落需取很多加入含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，同时锥形瓶中需加入10颗左右的玻璃珠；普通生长的或在4度保存的菌，接种时可以取1至5ml加入含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中。14) 检测菌液的OD值，若达到0.6-1.3，则可进行电转化。15) 配制10% 甘油+0.05% Tween 80并用0.2m滤器过滤, 置于冰中。16) 将40ml菌液转至50 mL离心管中，加入1013颗玻璃珠后，于涡旋器中充分涡旋5分钟后目的是将菌团块打散，于4度离心机中4000-8000rpm离心5-10分钟。弃上清千万小心，菌块很容易脱落。17) 加入40mL 10%甘油，于涡旋器中充分洗涤细菌后，于4度离心机中以4000-8000rpm离心5分钟，弃上清千万小心，菌块很容易脱落。18) 重复步骤5）1-2次后，留约1 mL上清视菌浓度而定，一般较稠，似大肠杆菌感受态细胞密度，用带滤芯的枪尖，吹吸充分混匀后于冰上放置。千万注意：枪杆不要碰到管壁。19) 于标记好的0.2cm的电转杯中，分别加入10 L 浓缩后的质粒DNA 和200 L分枝杆菌感受态细胞。轻柔吹吸充分混匀后于冰上放置10分钟。加入电转仪前擦尽电转杯上的水分，20) 用Bio-rad GenePulser点转移，以电压2.5KV、电阻1000 、电容25F脉冲波进行电转化。未加DNA的细菌阴性对照的脉冲时间应于1921秒间，该时间范围显示待转细菌处于良好状态。若感受态细胞洗得不干净或质粒含盐较多，会发生爆炸，不过很多情况下，爆炸后的也可以长出阳性克隆。 未发生爆炸的电转杯灭菌后仍然可用。21) 迅速用带滤芯的枪尖于电转液中加入2 mL 7H9(含吐温80)培养基(先用1 mL转移电转液，再用1 mL洗涤电转杯)，转移至50mL离心管中。千万注意：枪杆不要碰到管壁。 22) 于37度孵箱中孵育412小时，充分复活细菌并使其抗性表达。23) 用带滤芯的枪尖吹吸混匀后，1ml/1.5ml tube 分装，10000 rpm离心1分钟沉淀转化菌，弃上清，用0.6 mL 7H9培养基重悬后，以500 L/板铺于7H11(不含4-anti*)含相应抗生素40ug/ml HYG or 25ug/ml KAN培养板中。同时稀释一百倍后，500 L/板铺板。 可以尝试 制备的感受态于-80保存，过几周后进行转化实