标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量

标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、 标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。二、 蛋白质含量测定方法1、 凯氏定氮法2、 双缩脲法3、 Folin-酚试剂法4、 紫外吸收法5、 考马斯亮蓝法三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量标准曲线制作（一）、试剂：1、 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，加蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。2、 标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理2、移液管使用（三）、标准曲线制作：试管编号0123456100ug/ml标准蛋白（ml）0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/L NaCl （ml）10.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂 （ml）5555555摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A595nm1、2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。1）、利用标准曲线查出回归方程。2）、用公式计算回归方程。3）、或用origin作图 ，测出回归线性方程。即A595nm=aX( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。一般被测样品的A595nm值在0.10.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。（五）、注意事项：1、 玻璃仪器要洗涤干净。2、 取量要准确。3、 玻璃仪器要干燥，避免温度变化。4、 对照：用被测物质以外的物质作空白对照。药品的配制（磷酸缓冲液的配制）一、药品的配制步骤（一）、实验准备：1、 准备所需的药品和玻璃仪器。2、 洗涤。（怎样洗涤算干净？）（二）、计算：1、百分比浓度计算：1)、G/V比例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水。2）、V/V比：例如配75%乙醇100ml，75%100%=100%X, X=75ml。取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水。乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100 ml，200 ml混合。3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量。2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明。1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml。M=质量/体积（L）称取NaCl0.10.140=0.4g 摩尔数=G（g）/摩尔质量2）、0.1mMNaCl配100mlmM=毫摩尔数/体积（L） 称取NaCl 0.10.140=0.4g 毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量3）、0.1uNaCl配100mlmM=微摩尔数/体积（L） 称取NaCl0.10.140=0.4mg微摩尔数=G（ug）/摩尔质量 称取NaCl0.10.140=0.4ug 3、 混合溶液配制的计算：如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制。注意：1、分别标定体积计算2、分别配制再混合，但总体积不能 为100ml（三）、标量：1、 根据需要选择不同量程的天平根据要求去不同精度的测量器，如量筒或移液管。2、 电子分析天平的使用。（四）、溶解：1、 根据药品配置要求选择溶剂。蒸馏水，双蒸水，无离子水等。2、 只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤烧杯三次左右，直到洗涤干净。小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的常识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）。如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等）如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱促进溶解，但pH应在被要求的范围内。3、 加热促进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好。如:配0.1%的淀粉，水裕加热（温度在80-90。C），过量会糊化。（五）、定容：1、 用容量瓶定容；2、 用玻璃棒引流或用小漏斗；3、 用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度。要求刻度与液体凹面相切为止（眼睛可视）；4、 上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可。(注意不再定容了，防止溶液漏掉。)（六）、装入试剂瓶，贴上标签。标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等。（七）、清理实验场所。磷酸缓冲液（phosphate buffer）1mol/L 磷酸二氢钠（ml）1mol/L 磷酸氢二钠（ml）最终pH值920805.89001005.98771236.08501506.18151856.27752256.37352656.46853156.56253756.65654356.75104906.84505506.93906107.03306707.12807207.22308707.31908107.41608407.51308707.61058957.7859157.8759357.9539478.0按照下表所给定的体积，混合1 mol/L 的磷酸二氢钠（单碱）和1