第三章 灭火剂.doc

第三章 灭火剂、保护剂与免役佐剂第一节灭火剂为了提高生物制品的安全性，防止病原体扩散，很多疫苗都是将抗原灭活后制成的没有毒力和没有感染力的制品。灭活是生物制品中的一项非常基本技术！本章主要讲述：一、灭活的概念 二、灭活的类型 三、灭火剂 四、影响灭活效应的因素 五、灭活的检测一、灭活的概念微生物学意义上灭活有两层含义：1、是指破坏或杀死微生物使其成为没有生命物质的过程。2、生物制品上的灭活还有灭能的含义，是指将一些活性物质（微生物及其代谢产物、激素、酶、血清因子和抗体等）丧失活力的过程。例如：经过56度加热30分钟处理，可破坏诊断血清和待检血清中的补体活性，从而避免补体对诊断的干扰作用。生物制品意义上灭活的含义：是利用物理或化学的方法，破坏卫生物的生物学活性，破坏病原微生物的繁殖能力和致病能力，但仍然保留反应原性和免疫原性的过程。二 、灭活的类型按照灭活作用的性质可分为两类：物理灭活和化学灭活。其中化学灭活的效果确实、方法简单而且最为常用。灭活原理:使微生物蛋白，核酸，脂质等变性和失去活性，从而起到灭火的作用。1、物理灭活包括加热灭活、紫外线灭活和r射线灭活等方法。加热灭活：最早有smith等研制猪霍乱灭活菌苗时提出，后来在研制淋球菌苗时，发现热灭火容易使菌体蛋白发生变性，影响免疫原性。目前，除诊断抗原尚采用外，已经基本淘汰。紫外线灭活：效果不够确实，曾经发生过紫外线灭活的强毒重新活化的例子。R射线灭活：效果尚不十分清楚。2、化学灭活：利用化学药品或酶使微生物、活性物质的一些结构发生改变，从而丧失生命力，感染性，毒性或活性。然而，化学灭活的效能常受灭火剂种类，剂量和作用温度，PH，时间等因素的影响，因此，必须进行筛选最佳的灭活条件。在特定条件下，物理灭活与化学灭活也可以联合用于某些生物制品的灭活。三、灭火剂1概念:灭火剂又称化学灭火剂，用来灭活生物制剂活性的物质。在1911年由Lowenstein等用甲醛处理破伤风毒素，使毒性丧失而制成类毒素；以后在1924年Puntoni以0.1%苯酚或0.1%甲醛处理制成犬瘟热灭活苗，Dorset等（1934，1936）用结晶紫灭活猪瘟病毒制成猪瘟结晶紫疫苗。在我国，以1984年版规程为例，在20种灭活疫苗（包含类毒素）中甲醛灭活的有17种，苯酚灭活1%一种，结晶紫灭活的2种。到80年代，化学灭火剂的研究发展极快，已筛选出不少优良的灭火剂。2、常用灭火剂：（1）甲醛：是生物制品上最古典、最广泛使用的灭火剂。甲醛的水溶液-福尔马林，含甲醛36-40%。 甲醛的灭活机制是还原作用，低浓度时能破坏微生物的生命链，从而丧失活力而保存活力。；高浓度时与微生物蛋白质的氨基结合形成另一种化合物，从而破坏杀死微生物。 通常：用于菌苗灭活的浓度为0.1-0.8%；用于疫苗灭活的为0.05-0.1%。（2）苯酚：又称石碳酸。有腐蚀性，而且有毒！灭火机制：是微生物蛋白质变性和抑制如脱氨酶、氧化酶等酶系统的活性，从而导致微生物死亡。通常：0.2%浓度的苯酚可抑制一般细菌的生长，要杀死细菌则需要1%以上浓度的苯酚，另外，芽孢、真菌和病毒对苯酚的耐受性很强。（3）B-丙烯内酯：又名丙内酯。灭活机制：破坏病毒的核酸芯，但不损坏衣壳蛋白，因此保护性抗原成分得以保留，主要用于狂犬病灭活苗的制备。然而研究表明，丙内酯是一种潜在的致癌因子。（4）结晶紫：是甲基紫、龙胆紫的纯品。灭活机制：是结晶紫阳离子与微生物蛋白质带阴性电荷的羧基形成弱电离的化合物，从而干扰微生物正常代谢和氧化还原作用，主要干扰细胞壁粘肽的合成，导致革兰氏阳性菌生长繁殖受阻。（5）硫柳汞：常做消毒剂和杀菌剂用，百日咳菌苗作为灭火剂。（6）烷化剂：是含有烷基的分子中去掉一个氢原子基团的化合物，它能与另一种化合物作用，将烷基引入，形成烷基取代物。作用机制：是烷化微生物DNA分子中的鸟嘌呤和腺嘌呤，引起单链断裂、双螺旋链交联及干扰酶系统和核蛋白作用，从而破坏核酸代谢、合成，导致病毒核酸芯破坏而达到灭活目的。烷化剂灭活可使病毒丧失感染力而不损害蛋白壳，得以保留其抗原性。有缩水甘油醛、N-乙酞乙烯亚胺、二乙烯亚胺。缩水甘油醛：50年代末合成的一种烷化剂，曾用于大肠杆菌噬菌体、新城疫病毒、口蹄疫病毒等灭活，灭活效果优于甲醛。灭活机制：环氧烷基作用于病毒蛋白、核酸而导致丧失毒性。乙酞乙烯亚胺：起烷化作用的功能团是乙烯亚胺基，其灭活效果在病毒要高于细菌。灭活口蹄疫病毒的剂量为0.05%二乙烯亚胺：是乙烯亚胺的一种衍生物。口蹄疫病毒灭活时。最终浓度为0.05%四、影响灭火剂灭活的因素所谓灭活效果：一是指灭活的完全性，即被灭活物的活性（毒性）是否能完全丧失或破坏。二是灭活后是否保留良好的抗原性，即灭活物是否仍有抗原高效价和坚强的免疫力。灭活效果，尤其化学灭活的效应，常受剂量、温度、时间、PH、灭活物种类、特性和浓度等因素制约。一般灭活速度常随灭活剂量、温度增高而递增，而灭活时间又与剂量温度成反比。因此，在生物制品制造中。除应筛选出良好的灭火剂外，还要选定最佳的灭活剂量、温度、时间和PH等条件。1、灭火剂种类不同灭火剂对同一种微生物的灭活效果不同。如某些药物只对一部分微生物有明显的灭活作用，而对另一些微生物作用效力很差。如：口蹄疫病毒经甲醛灭活17天后，仍可分离出有活性的核酸，且能致死小鼠，用AEI灭活则能使核酸丧失感染性达到完全灭活。又如：在牛流行热病毒灭活试验中比较了甲醛、B丙内酯和紫外线三种灭活效果，其中甲醛的灭活效果最好，免疫原性也优良。2、温度同一浓度的灭火剂在不同温度的灭活速度与温度成正比，灭活温度越高灭活越快。但是温度超度40或更高，就会对微生物的抗原性有不利的影响。3、灭活物浓度一般情况下，被灭活物的浓度越高，则灭活时间越长。4灭火剂的浓度一般情况，灭火剂浓度越高，灭活脱毒越快，但抗原损失量也较大。5灭活时间 灭活时间与灭火温度和灭火剂的浓度密切相关。一般随着灭火剂浓度及作用温度升高，灭活时间所需时间缩短。但为了保证质量一般采用低浓度、低温度和短时间处理为最佳。6、PH在微酸性时灭火速度慢，抗原性保持较好，在碱性时灭活速度快，但抗原易受破坏。对细菌的灭活作用，PH有重大影响，ph改变时，细菌的电荷也发生改变。在碱性溶液中，细菌带阴电荷较多，所以阳离子表面活性剂的杀菌作用较大。在酸性溶液中，恰好相反。7、微生物的种类与特性不同种类的微生物如细菌、病毒、真菌以及革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌对各类灭火剂的敏感性完全不同。细菌的繁殖体及其芽孢对化学药物的抵抗力不同，生长期和静止期的细菌对灭火剂的敏感程度也有差别。8 灭活物内的杂物杂物越多灭活时间长，灭活剂量高。例如：制造组织灭活苗时，所用灭活剂量和灭活时间要比细胞灭活苗时高和长。以甲醛为例，制造兔出血症组织灭活苗，甲醛 浓度为0.4%-0.8，而灭活细菌为0.1%-0.8，灭活病毒时为0.05%-0.1因此 ，在生物制品制造中，除应筛选出良好 的灭活剂外，还要选定最佳的灭活剂量、 温度、时间以及其他条件。第二节 保护剂指保护微生物、寄生虫等活力和酶、激素、免疫反应物等活性的一类物质。又称稳定剂(stabilizer)(stabilizer)，在冷冻真空干燥制品中广泛应用就其组成讲，保护剂是一种混合物。既含有不能利用的成分;也含有可利用的营养成分1、保护剂种类按化学成分分为：复合物类：脱脂乳,明胶,蛋白质及水解物, 酵母浸液,血清等聚合物类：葡聚糖,聚乙二醇,聚乙烯毗咯烷酮等糖类：蔗糖,乳糖,果糖,麦芽糖,棉子糖,已糖,葡萄糖等醇类：山梨醇,甘油,甘露醇,肌醇等酸类：氨基酸,拧檬酸,酒石酸, EDTA,磷酸等盐类：氯化钠,氯化绅,氯化铰,乳酸钙,谷氨酸钠等抗氧化剂类：维生素C和E,硫脲等（2）按分子大小以及抗氧化性分类 低分子物质 ：谷氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、赖氨峻、苹果酸、乳糖酸、 葡萄糖、乳糖、蔗糖、棉子糖、山梨醇等 高分子物质： 脱脂乳、明胶、血清、脱纤血液、羊水、蜂蜜、酵母浸汁、 肉汤、蛋白胨、淀粉、糊精、果胶、阿拉伯胶、右旋糖酐、 聚乙烯毗咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素等 抗氧化剂 维生素 E、硫脲、碘化钾、铜酸铵等C2、保护剂的功能既有生物学作用，也有物理学效应保护微生物和活性物质在冻干过程中理化因素的影响或损伤，维持较高的存活率和活性。例如：菌苗的活菌数、疫苗的病毒滴度、酶的活性等；使微生物、活性物质处于半静止或静止状态，以延长生命、活性期。 活性物质在冻干过程中保持原有的构架， 使制品形成海绵状结构 抗氧化剂能抑制氧化作用，从而维持微 生物、活性物质稳定以及静止状态。 3、保护剂的作用机理不同的保护剂，其作用机制不同防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致活性的损伤；降低细胞内外渗透压差、防止细胞结构水结晶，以保持细胞的活力；保护或提供细胞复苏所需的营养，有利于活力的复苏和迅速修复自身。6、影响冻干保护剂效能的因素（1）保护剂种类利用不同保护剂冻干的同一种微生物的保存期的存活率不同。 如：分别用7.5葡萄糖肉汤和7.57.5乳糖肉汤作保护剂冻干的沙门氏菌，在室温保存7个月后的细菌存活率分别为35%与21%（2）保护剂浓度： 以大肠杆菌加不同浓度葡萄糖作保护剂 进行冻干，并测定冻干品的细菌存活率， 证明 510510葡萄糖存活率最高）（3）保护剂配制方法 配制方法的不同往往能影响保护剂的效果，例如含糖保护剂灭菌温度不宜过高，否则由于糖的炭化而影响冻干制品的物理性状和保存效果，所以均以11430min灭菌。又如血清保护剂就不能用热灭菌法，必须以滤过法除菌。（4）保护剂 的pH保护剂的pH应与微生物生存时的pH相同或相近，过高或过低都能招致微生物的死亡。例如明胶蔗糖保护剂的pHpH以6.87.0为最佳，否则会造成微生物大量死亡。又如含葡萄糖、乳糖保护剂经高压灭茵后能或多或少改变保护剂的pHpH值，从而影响保护效果，为此最好采取滤过除菌。因此，每种新的冻干制品在批量生产前应进行系统的最佳保护剂选择试验，包括 : 保护剂冻干前后的活菌数、病毒滴度和效价测定的比较试验 不同保存条件和不同保存期的比较试验 即使在冻干制品投产以后，仍须根据条件的改变不断作选择试验，以改进冻干制品的质量4、适用于微生物的保护剂病原细菌常用的有：5蔗糖，10脱脂乳，5蔗糖脱脂乳，1.5明胶灭活犊牛血清，灭活马血清。厌氧菌常用的有： 10脱脂乳，7.5葡萄糖血清，0.1谷氨酸钠，10%乳糖溶液支原体常用的有：3脱脂乳、5葡萄糖混合液，12蔗糖，1牛血清白蛋白，7.5葡萄糖，1牛血清白蛋白立克次体 常用：10脱脂乳酵母菌 ：常用： 马血清，7.5葡萄糖马血清病 毒 ：明胶，血清，蛋白胨、血清蛋白，乳糖， 蔗糖，葡萄糖，谷氨酸钠，山梨醇，聚乙烯 毗咯烷酮等。 可不同浓度单独或混合组成保护剂使用5、兽医生物制品常用的保护剂（1）5蔗糖（乳糖）脱脂乳成分：蔗糖（乳糖）：）5g脱脂乳加至100mL制法：充分溶解， 110-116高压灭菌30-40min；无菌检验阴性，4保存备用。用途： 羊痘鸡胚化弱毒冻干苗、鸡新城疫I系、IIII系冻干苗、鸡痘鹌鹑化弱毒冻干苗、鸭瘟鸡胚化弱毒冻干苗等。（2）40蔗糖明胶成分 蔗糖40g，明胶12g，蒸馏水加至100mL制法 混合溶解，调 pH 6.8-7.0 ，116高压30-40min。无菌检验阴性， 4保存供配苗用。用途 ：猪肺疫弱毒冻干菌。（3）聚乙烯毗咯烷酮乳糖 成分 聚乙烯毗咯烷酮1g乳糖10g蒸馏水加至100mL100mL制法： 混合溶解， 120高压灭菌20min，无菌检验应阴性， 4保存供配苗用。用途 水貂犬瘟热细胞冻干苗。（4）SPGA成分 ：蔗糖76.62g磷酸二氢钾0.62g磷酸氢二钾（3H20）1.64g谷氨酸0.83g牛血清白蛋白10g无离子水加至1000ml制法 ：混合溶解，除菌滤过无菌检验应阴性， 4保存供配苗用途 ：鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒苗第三节 佐剂佐剂是免疫学和生物制品学中的 一个重要内容对增强机体对抗原的免疫应答，提高生物制品的免疫效应发挥着重要作用什么是 “佐剂”呢？是指与抗原物质混合或先于抗原或同时注入动物体内，能非特异性地增强机体对抗原物质的免疫应答的一类物质。也称为免疫佐剂、抗原佐剂一、 研究历史1、起始阶段 该阶段多是铝佐剂在生物制品上的应用研究。1916年，Moignae最早用羊毛脂与石蜡油制成伤寒沙门氏菌乳剂苗；继后Prevet用羊毛脂加琼脂为佐剂制出炭疽菌苗。1925年，Gaston Ramon证明了明矾的佐剂作用该阶段多是铝佐剂在生物制品上的应用研究2、1950年代为提高兽医生物制品的免疫效果，在兽医领域对佐剂进行了广泛