曹汗2008413110.doc

毕业设计（论文）译文题目-葡萄糖苷酶固定化及对茶饮料香气增加的影响 学生姓名 曹汗 学号 2008413110 专业 生物工程 班级 2008413110 指导教师 郭金玲 评阅教师 完成日期 年月日-葡萄糖苷酶的固定化及对茶饮料香气增加的影响a茶叶生物化学与生物技术的农业及教育部、 安徽省农业大学、 安徽省合肥市 230036 公关中国重点实验室b东亚中国大学的科学和技术，上海 200237，公关中国、 新世界生物技术研究所生物反应器工程国家重点实验室摘要通过交联 - 包埋 - 交联-葡萄糖苷酶有效地与海藻酸钠进行固定化。固定化条件的优化后, 活性恢复的固定化 -葡萄糖苷酶提高46.0%，对-葡萄糖苷酶固定化的条件进行了调查。其优化的温度被确定为 45 C，与未固定化的酶相比下降了10 C，而最佳的 ph 值并没有改变。固定化 -葡萄糖苷酶的热和 ph 值的稳定性增加到一定程度。-葡萄糖苷酶固定化的Km值估计是 1.97 10年率mol/l。固定化的 -葡萄糖苷酶还被应用于对茶饮料香气影响的研究。结果显示 -葡萄糖苷酶固定化处理后、使得绿茶，乌龙茶，红茶中的挥发油总量增加了20.69，10.30和6.79。固定化 -葡萄糖苷酶的贮存稳定性和可重用性都大为改善，存储 42 天后其活性7任保留73.3%，并且重复使用的 50次后其活性还有93.6%。关键字: 固定化 -葡萄糖苷酶 茶饮料 增加香气内容1.简介.22.材料和方法.3 2.1物料 2.2-葡萄糖苷酶的固定化.32.2.1固定化褐藻.32.2.2。固定化壳聚糖.3 2.3测定葡萄糖苷酶活性.3 2.4-葡萄糖苷酶的特性.3 2.5茶叶溶液的制备.4 2.6-葡萄糖苷酶对茶溶液的影响.4 2.7香气成分分析.52.71香精油的制备(SDE 法) .52.7.2 GC 分析.5 2.8贮存稳定性和可复用性.63结果与讨论.6 3.1载体和方法对固定化的影响.6 3.2交联 - 包埋 - 交联方法的优化.73.3-葡萄糖苷酶的特性。.73.3.1最适温度和热稳定性.73.3.2最适pH值和pH稳定性.33.4固定化酶对茶饮料的增香效果.7参考文献. 81. 简介因为罐装液体在20世纪80年代成功地利用，茶饮料已迅速成为一个国际饮料市场的主要产品。茶叶香气是一个在确定茶饮料质量的最重要因素。然而茶饮料香气薄至今未解决。目前大多数的茶饮料为提高香气的需要，在市场销售中加入食用精油。其中有500余种茶叶香气成分，单萜醇，如芳樟醇和香叶，芳香醇类如苯甲醇和2 - 苯等，其中有一个花香或水果（水果类）的气味在很大程度上有助于茶的香味，这种茶被称为花香茶（王，2003）。这些单糖或双糖无味苷前体香气化合物存（D-glucopyranosides）鲜茶树叶中（小林等，1994;矢野等人1990年，月亮等，; Nishikitani等，1996）。糖苷前体能被例如-葡萄糖苷酶水解成自由芳香成分，（Wang 等等2001；Ogawa 等等1995）但是，茶植物糖苷酶在茶制造业的过程期间展示在枯萎的本质状况下面的低活力和结构的高度破坏，流失，和发酵。因此，经过外生的糖苷酶糖苷前体加入，糖苷酶将大部分的在茶产品的生产中保留并在改进茶的芳香品质方面有很大的大的潜力。 -葡萄糖苷酶在整个植物界广泛的分布。他们水解-葡萄糖苷前体并释放非还原性-葡萄糖残基和终端苷元。近年来，对于-葡萄糖苷酶的转糖基化的能力有了很多的研究与关注，由于这些类型的反应在酒或饮料行业有很大的重要作用，因为他们改善香气的能力（Jatinder等，2007）。-葡萄糖苷酶已被用于水解糖苷前体，以增加香气增加茶饮料质量（Nicolus等，1997）。然而，很少有研究人员调查研究了固定化的-葡萄糖苷酶及其在茶饮料中的作用及应用。随着固定化酶，酶提高了它的稳定性，重复使用性，及工业的连续生产，并能更好地控制反应和使生产有更好的经济效益。因此通过-葡萄糖苷酶固定化，能使茶品生产更容易更有效经济。因此对固定化优化，-葡萄糖苷酶固定化的特点和它对茶饮料香气增加的效果进行了详细调查与研究。2材料和方法2.1物料 海藻酸钠购自广东汕头市西陇化工厂。壳聚糖购自浙江玉环县海洋生物化学公司。-葡萄糖苷酶(Fluka ,1214 毫克）、对硝基苯酚-D-葡萄糖苷(pNPG, Sig2ma) 、戊二醛( GA , E Merck) 、海藻酸钠(广东汕头市西陇化工厂) 、儿茶素标准品EGCG、EGC、ECG、EC、DL2C(Sigma) 。香气标准品:顺232己烯醇、苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、水杨酸甲酯、香叶醇、癸酸乙酯(内标) 系日本学者山西贞教授馈赠。其他试剂和药品均为国产分析纯。2.2-葡萄糖苷酶的固定化2.2.1固定化褐藻 直接制取取-葡萄糖苷酶溶液2.5ml（液浓度mg/ mL)，按,6.71 的体积比加入10 %的海藻酸钠溶液6.7 mL ,充分混匀后加2.5 %的戊二醛使其在溶液中的最终浓度达到1.25 % ,振荡0.5h,于20 静置交联4 h 。用5 号针头注入2.0 %的CaCl2 溶液。钙-海藻酸钠珠形成。将小珠从溶液真空过滤分离并和新的2.0的氯化钙溶液硬化1h。再次将小珠分离并用50mm的柠檬酸钠缓冲液（pH值5.0）清洗过滤器两次。包埋法包埋前期处理与上面相同，然后包埋，用0.025戊二醛交联2.5小时形成小珠。然后将小珠分离并用50mm的柠檬酸钠缓冲液（pH值5.0）清洗过滤器两次。 交联法取2.5毫升的葡萄糖苷酶与6.7毫升3.0的海藻酸钠溶液进行混合30分钟，搅拌以确保完全混合，充分混合后加入1.3毫升2.5的戊二醛，用振荡器将混合物振荡30分钟，静置3小时交联。包封最后的混合物。交联包埋法交联和包埋的过程相结合的交联包埋法。2.2.2。固定化壳聚糖壳聚糖预处理加 ，以达到一个透明的胶体状态，用5.0的氢氧化钠溶液调节混合物的pH值到7，静置有絮状沉淀，絮状物用去离子水清洗并用真空干燥设备干燥。交联壳聚糖载体的制备取2克预处理壳聚糖然后向其中加入加入50毫升5.0的戊二醛溶液，混合搅拌4小时，然后静置8小时。用真空过滤器分离交联壳聚糖载体，然后用50MM柠檬酸钠缓冲液（pH值5.0），完全清洗过滤器。直接吸附先预处理0.5克壳聚糖，用柠檬酸钠缓冲液（pH值5.0）和2.5 ML-葡萄糖苷酶在4摄氏度时缓慢的混合搅拌4小时，静置8小时然后用真空过滤器将壳聚糖与吸附酶分离出来，再用50mm的柠檬酸钠缓冲液（pH值5.0）冲洗。吸附交联吸附过程与上面的描述相同，吸附后壳聚糖吸附酶进行分离，然后加入并加入12.5毫升5.0的戊二醛溶液，然后在4C缓慢的搅拌4.0h，静置交联8.0h，再用真空过滤器分离固定化酶，然后用50mm的柠檬酸钠缓冲液洗清洗过滤器交联，吸附0.5克交联壳聚糖载体和5.0毫升50mm的柠檬酸钠缓冲液（pH值5.0）和2.5毫升 - 葡萄糖苷酶溶液（0.1mgsolid/ml）在4摄氏度时缓慢搅拌4小时，然后静置8小时，然后用真空过滤器将壳聚糖与吸附酶分离出来，再用50mm的柠檬酸钠缓冲液（pH值5.0）冲洗。交联吸附交联主要过程是交联吸附和吸附交联的相组合。2.3测定葡萄糖苷酶活性 根据根据燕，林（1997）和matsuva（1995年）等人的分光光度法对-葡萄糖苷酶的活性的测定做了少许的改变来测定-葡萄糖苷酶的活性。让50 L-葡萄糖苷酶溶液，0.9毫升的混合物，50mm的柠檬酸钠缓冲液和50升，10 mmol / L的PNPG在35摄氏度时混合反应10分钟，然后向其中加入1毫升1.0 mol / L的碳酸钠溶液，使反应终止。确定固定化-葡萄糖苷酶活性的方法是其在在405纳米处有最大吸收波长。50 L-葡萄糖苷酶才相当与0.1克固定化酶。在一定的条件下相当于0.01摩尔PNP活性的-葡萄糖苷酶定义为一个活性单位，计算固定化-葡萄糖苷酶的活性回收率为：（）=（总活性固定化酶/酶液的总活性）100。2.4-葡萄糖苷酶的特性 通过在50mm的柠檬酸钠缓冲液（pH值5.0）中在20-70摄氏度范围内不同温度条件下测定酶的活性从而来确定-葡萄糖苷酶的最适活性温度，通过在50mm的柠檬酸钠缓冲液（pH值5.0）中在20-80摄氏度范围内不同温度条件下通过测量残余的-葡萄糖苷酶活性来确定其热稳定性，在不同的ph值下-葡萄糖苷酶有不同的活性，要确定其ph稳定性，是在20摄氏度ph3-8范围内静置3小时然后测量其剩余活性。测定的-葡萄糖苷酶的活性及Km值是通过PNPG的各种浓度来表示的，在这些实验中使用固定化酶的活性是通过测定Km值，而Km值根据Lineweaver和伯克作图法作出通过计算求出。2.5茶叶溶液的制备 取20 g的绿色或黑色或乌龙茶样品85C蒸馏15分钟，从中提取1000毫升，将其过滤再取液进行气相色谱分析。2.6-葡萄糖苷酶对茶溶液的影响 250毫升茶溶液和10克-葡萄糖苷酶在45摄氏度用三角瓶振荡(100 rpm)2小时然后过滤，取滤液气相色谱分析。2.7香气成分分析2.71香精油的制备(SDE 法)取1.2.3 和1. 2.4 制备的茶汁各200 mL ,置于1 000 mL圆底烧瓶中,加5010g/ mL 癸酸乙酯内标溶液1. 0 mL ,加热至微沸并保持50 min ,溶剂瓶中加入30 mL 无水乙醚,45 水浴回流萃取,50 min 后收集乙醚液,加入适量的无水Na2SO4 脱水。进样前将乙醚溶剂经氮气吹扫浓缩至0.1 mL ,备GC 分析。2.7.2 GC 分析 安捷伦6890 型气相色谱, FID 检测器,色谱柱:HP2INNOWax 19091N2133 (30m 0125 mm I1D1 0125m) ;载气:N2 (2 mL/ min) ;50 (5 min) 程序升温(3 / min) 至190 (10 min) ;不分流进样,进样量110L 。以顺-3-己烯醇、苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、水杨酸甲酯、香叶醇等6 种标准样的相对保留时间及参考相关文献数据进行组分定性。以香气成分峰面积除以内标峰面积,计算各组分的相对含量。2.8贮存稳定性和可复用性 固定化-葡萄糖苷酶的存储稳定性是通过计算其存储一段时间后的剩余活性。将活性-葡萄糖苷酶存储在50mm的柠檬酸钠缓冲液（pH值7.0）中，配成浓度为0.1mg/ml的溶液，4摄氏度下存放，定期测定其活性，一般一周一次。 通过使用间歇式搅拌反应器对固定化-葡萄糖苷酶的可重用性进行研究，在反应器中放入适量的固定化-葡萄糖苷酶和2.5绿茶溶液（1:20，W / V）45摄氏度下反应2两小时，在反应结束后用柠檬酸钠缓冲液（pH值7.0）对固定化-葡萄糖苷酶进行洗涤以消除其他残余基，然后将其放入新的反应介质并在最佳检测条件检测其活性。3结果与讨论。3.1载体和方法对固定化的影响选择两种被广泛应用的载体海藻酸钠，壳聚糖用来固定化（Ravichandra等，2008;东芝2007年qayyum Emese等人，2007年，2008年）并且用四个不同的固定方法进行研究，结果表明对-葡萄糖苷酶的固定化，海藻酸钠的固定效果优于壳聚糖并且交联吸附交联的方法是4种方法中最好的，-葡萄糖苷酶的活性回收率可达到31.4（见表1）。海藻酸钠作为乳化剂用于食品工业增加粘度，换句话说，它是安全的食品添加剂，因此，-葡萄糖苷酶固定在海藻酸钠钠可用于改善茶饮料，此外，海藻酸钠很便宜的，并且这个固定的方法很简单。3.2交联 - 包埋 - 交联方法的优化采用海藻酸钠作为固定化载体和交联 - 包埋 - 交联作为固定化方法，-葡萄糖苷酶的活性回收率只有31.4，这个回收效率有点低，在交联 - 包埋 - 交联方法中有几个影响-葡萄糖苷酶活性的参数，这些参数包括戊二醛的浓度，交联反应时间，交联反应温度，海藻酸钠浓度，氯化钙溶液的浓度和硬化时间。我们优化这些参数，并得到-葡萄糖苷酶固定化的最佳条件：2.5毫升的-葡萄糖苷酶溶液（0.1mgsolid/ml）与3.0的海藻酸钠溶液6.7毫升以0.75:1（V / V）的比例混合，混合搅拌（30分钟）确保彻底完成混合，经过充分混合，在溶液中添加2.5戊二醛，使其终浓度达到1.25和振荡器上振荡30分钟，然后放置在20C下4h，再用注射器向溶液中滴入2.0氯化钙溶液，CA-海藻酸钠珠形成。 图1图2 从氯化钙溶液中分离出小珠并真空过滤，再用新的2.0的CaCl2溶液处理，放入冰箱中2小时。然后取出小珠进一步在10摄氏度下与0.075戊二醛交联小时，再次取出小珠并用50mm的柠檬酸钠缓冲液（pH值5.0）冲洗过滤。当在这些最佳条件下固定-葡萄糖苷酶活性回收率增加了14.6，达到46.0。3.3-葡萄糖苷酶的特性。3.3.1最适温度和热稳定性 在(2070 C).对固定化-葡萄糖苷酶的最适活性温度进行了研究，结果表明，固定化-葡萄糖苷酶的最适活性温度是45 C (Fig. 1(A) 最佳温度下降10C后固定。一般来说，固定可能会提高或不会改变酶作用的最佳温度，（Neerupma等，2006; Mulagalapalli。等人，2007年，1982年Makkar; Roila等，2007年，布鲁诺等，2005）。有少数报告显示如果减少固定的最佳温度，将会得到一个非常有趣的结果，它可能对茶饮料加工非常有利，因为固定化-葡萄糖苷酶可以在较低的温度下仍有活性，从而可避免高温造成茶褐色。 固定化-葡萄糖苷酶的热失活率的研究是在2080 C.范围内，结果表明固定化-葡萄糖苷酶的活性在20 C t到 40C 范围内是相当稳定的，然后随着温度的升高在60 C时葡萄糖苷酶的活性迅速下降，其相对活性仅保留10，但固定化-葡萄糖苷酶的活性在70 C任呈缓慢下降趋势，仍保留30。(Fig. 1(B) 结果表明固定化-葡萄糖苷酶的活性大大增加。这是因为固定和交联为-葡萄糖苷酶提供了更多的刚性外部结构，其效果是较高的温度下，打破相互作用时，被包裹的-葡萄糖苷酶活性部位被保护了起来，从而增加了-葡萄糖苷酶热稳定性。3.3.2最适pH值和pH稳定性 在ph3.08.0范围内对固定化-葡萄糖苷酶进行了研究。3.4固定化酶对茶饮料的增香效果 经固定化酶处理后,各类茶的香精油总量均有所增加,其中以绿茶的香精油总量增加最多,增幅达20169 % ,乌龙茶为10130 % ,红茶为6179 %(图1 、表1) 。这说明固定化的-葡萄糖苷酶对3 种茶类中存在的糖苷类前体均有一定的水解作用,3 种茶类香精油总量增加的差异可能与它们的加工工艺有关,绿茶加工中先经过高温杀青,使其内源酶灭活,糖苷类前体避免了酶的水解作用而得以保存,但是红茶、乌龙茶却与此相反,不但不使内源酶灭活,还要创造适宜的条件促使内源酶充分发挥作用,从而导致大量的糖苷类前体在加工过程中就水解释放,乌龙茶优于红茶是因为其发酵程度比红茶低,相应地糖苷类前体保存就较红茶高。通过考察茶叶中几种主要游离态和键合态香气成分的含量变化(图1 、表2) ,可以看出,经固定化酶处理后,绿茶中除苯乙醇变化不明显外,其他香气成分的含量均有显著增加, 增幅依次为: 芳樟醇(328160 %) 水杨酸甲酯( 245100 %) 香叶醇(52100 %) 苯甲醇( 24150 %) 顺232己烯醇(21177 %) 苯乙醇(0107 %) ;乌龙茶中的香气成分含量增加也较显著,增幅依次为: 水杨酸甲酯(92197 %) 芳樟醇(61182 %) 香叶醇(36160 %) 苯甲醇(28169 %) 苯乙醇(27174 %) 顺232己烯醇(10131 %) ; 红茶中几种香气成分增加并不显著,增幅依次为:苯甲醇(66118 %) 香叶醇(27193%) 芳樟醇(18198 %) 顺232己烯醇(8124 %) 水杨酸甲酯(2114 %) 苯乙醇(0145 %) 。就3 大茶类的6 种成分比较而言,可以看出,顺232己烯醇、芳樟醇、水杨酸甲酯、香叶醇的增长率均为:绿茶 乌龙茶 红茶;苯甲醇的增长率均为:红茶 乌龙茶 绿茶;苯乙醇的增长率均为:乌龙茶 红茶 绿茶。造成这种现象可能是因为不同茶类中不同香气前体的存在形式、含量、种类不同以及与-葡萄糖苷酶的底物特异性有关。-表2 固定化酶处理对不同茶类主要游离态和键合态香气成分含量的影响绿茶 乌龙茶 红茶F E I/ % F E I/ % F E I/ %顺-3-己烯醇 02293 012792 21177 010291 010321 10131 010619 010670 8124芳樟醇 011476 016326 328160 014434 017175 61182 012327 012536 8198水杨酸甲酯 010443 011529 245100 011538 012968 92197 011121 011145 2114香叶醇 018282 112588 52100 013317 014531 36160 012803 013586 27193苯甲醇 010628 010782 24150 011495 011924 28169 010204 010339 66118苯乙醇 011403 011404 0107 011276 011630 27174 110033 110079 0145注: F 代表未经固定化酶处理,E 代表经固定化酶处理, I 代表增长率; I ( %) = ( E 精油量2F 精油量) F 精油量100 %。精油含量= 名香气峰成分面积内标峰面积。译自：food and bioproducts processing 8 8 ( 2 0 1 0 ) 8389参考文献1 周纪东1 黑曲霉产单宁酶的研究和有机相中固定化黑曲霉细胞合成没食子酸丙酯的初探D1 浙江大学硕士学位论文, 20022 Emese, B., gnes, S., Nmeth, C.S., Tivadar, F. and Jnos, G., 2008,Preparation of chitosan particles suitable for enzymeimmobilization. J Biochem Biophys Methods, 70(6): 12401246.3 苏二正,夏涛. 饮料中蛋白质2多酚混浊的研究进展J .食品科技, 2004 , (3) :70734 夏涛, 童启庆. 茶叶香气前驱体研究进展J . 茶叶,1996 ,22 (1) :14175张正竹. 绿茶主要香气物质的糖苷类前体研究D . 湖南农业大学博士学位论文, 20006 Guo, W., Sakata, K., Watanabe, N., Nakajima, R., Yagi, A., Ina, K.and Luo, S., 1993, (S) Geraniol6-O-d-xylopyanosyl-d-glucopyranosides isolated as