基因工程技术概述.doc

基因工程技术第1章 绪论1 基因工程： 在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。2基因工程要素：包括外源DNA；载体分子、工具酶和受体细胞等。3基因工程的研究内容：（1）目的基因的获取： 从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。（4）重组体的培养: 对转入重组子的受体细胞进行培养,以扩增DNA重组子或使其整合到受体细胞的基因组中。 ( 5 ）克隆的鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）（6） 目的基因的表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。第二章 基因工程的酶学基础第一节 限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。来源：主要来源于原核生物性质：内切酶，即在DNA分子内部制造切口的酶功能：自我保护细菌的限制修饰系统：限制，将侵入细菌的外援DNA进行分解形成小片段；修饰，细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。2、 限制性内切酶的类型 型限制性内切酶 、 型限制性内切酶、 型限制性内切酶1、 类限制性内切酶的基本特性 ：（1） 识别位点序列：未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）。与DNA的来源无关，即没有种的特异性。（2） 切割位点：识别位点处，切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。1 粘性末端：含有几个核苷酸单链的末端，分为5端突出，和3端突出2 粘性末端的意义： 连接便利：i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 末端标记：A 末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记B 末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。 补平成平齐末端：粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端3 平齐末端（blunt end）：在识别序列的对称轴上同时切割4 平齐末端的特点：连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的1%，这种连接常出现多联体连接粘性末端与平齐末端连接的处理方法：）添补法：利用DNA聚合酶 (klenow fragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。）削除(平)法：利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端5 同裂酶（Isoschizomer)：不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。 完全同裂酶：识别位点和切点完全相同 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。6 同尾酶(Isocaudamers）：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别7 限制酶的酶活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。 星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 诱发星号（*）活性的原因：）高甘油含量）内切酶用量过大）低离子强度）高pH）含有机溶剂，如乙醇）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳离子的存在8s型限制性内切酶移动切割（shifted cleavage):在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。（3） 型限制性内切酶不具有甲基化功能：型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。它们识别相同的DNA序列，但功能不同。（4） II型限制性内切酶对单链DNA的切割：定义为切割双链DNA，但有一些还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低3. 类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）4、 限制性内切酶酶解反应条件1. 标准酶解体系的建立：一个单位（U）的限制性内切酶定义：在合适的温度和缓冲液中，在20l的反应体系中，1h完全酶解1gDNA所需要的酶量。2酶解过程：配酶解体系、混匀、反应终止、酶解结果鉴定第2节 DNA 连接酶一、定义：一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶二、特点：1. 两种共价连接DNA限制片段的DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端，背景低，准确性高（2）T4噬菌体的连接酶，不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端2. 连接条件（1）必须是两条双链DNA（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）（3） 需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+（4） DNA连接酶的反应条件： 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA（Hind 片段）所需的酶量。第3章 基因工程载体一、载体（vector) 1定义：是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分；基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。2载体的功能 ：运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件3载体的要求:A、复制起点：能在受体中复制；B、筛选标记；C、限制性内切酶切割位点；D、载体的大小：原则上要求载体越小越好；E、适当的拷贝数；F、载体的安全性：质粒不能随便转移;G、外源基因的表达：启动子。第1节 表达载体1常用的遗传标记基因 -半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZ） -半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具-半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZ）均可作为标记基因。 -半乳糖苷酶基因的优点: a.酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZ编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量大2常用质粒载体 （1）pBR322 复制起点 ori：pMB1系列（来源于ColE1）高拷贝型复制起点 Ampr基因：pSP2124质粒的Ampr基因 Tetr基因：pSC101的Tetr 基因。 长度：4363bp 选择标记：氨苄青霉素和四环素抗性。 克隆位点：含有多个克隆位点。 Ampr基因内可被Pst I，Pvu I，Sac I切开，而Tetr基因可被BamH I，Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。pBR322重组克隆的筛选 重组克隆的 “插入失活”筛选方法 pBR322插入在Tetr中，基因型为Tets 、Ampr在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长； pBR322插入在Ampr中，基因型为Tetr 、Amps、在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。 （2） pUC系列质粒载体 在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体，其组成如下： 含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。 含有大肠杆菌b -半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码a -肽链的DNA序列，即lacZ基因。 在lacZ基因中靠近5端的一段有MCS区段，但并不破坏该基因的功能。 （3）穿梭质粒载体(shuttle vector) ： 这种质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞中复制并检测，如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。第2节 表达载体克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可； 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。 表达载体构建的一般原则 1.阅读框架与外源基因高效表达 2.启动子与外源基因高效表达 3.转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达 4.有效的翻译起始与外源基因高效表达 5.终止密码子选择与外源基因高效表达 6.外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达真核基因在原核细胞中表达，载体必须具备的条件： 载体能够独立复制，具有复制起点。 应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆 鉴定和筛选。 应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。 应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。最佳启动子具备的条件： 第一 必须是强启动子 第二 启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平 第三 启动子应是诱导型的（热或化学诱导）第4章 目的基因的制取第1节 目的基因1. 基因的组成基因：染色体上具有遗传功能的DNA片段，它包括结构基因和相关的调控序列。 1) 原核生物的基因组成操纵子（Operon）：功能密切相关的基因聚集在一起，处于同一个转录启动区的调控 之下，并具有相同的转录终止区.启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。SD序列：核糖体识别和结合的序列，通常位于起译密码子上游4-9bp处。序列特征为：AGGAGG, 它与核糖体核糖体16S rRNA的3序列3 UCCUCC 5互补配对，从而使核糖体与mRNA结合,启动翻译过程。编码区： 翻译起始密码（ATG）：位于SD序列后4-9bp ；多肽链编码区： 翻译终止密码（TAG，TGA,TAA）：某些基因后面只有一个终止密码，某些基因后面有两个终止密码.转录终止区:终止子：原核生物基因在转录终止前的一段提供转录终止信号的DNA序列（Terminator）.特点：回文结构，转录后可形成发夹状的结构，从而使聚合酶减慢或停止前进. a）不依赖于终止因子的终止子（简单终止子） 含有寡聚T序列和一段富含GC的序列 b）依赖于终止因子（）的终止子. 不含寡聚T序列，回文结构不含富GC的序列终止因子：帮助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（Termination factor） 2) 真核生物基因组成真核生物基因组的一般特点 a）基因位于染色体上，基因之间存在较长的非编码区 b）一个结构基因内有一个或多个非编码的间隔序列转录启动区：真核生物的三类RNA(rRNA, mRNA, tRNA)分别由RNA聚合酶I、II和III进行转录.它们启动子的结构也不相同.编码蛋白质的启动子由RNA聚合酶II识别.基因区：特点：a）无类似于原核基因中的核糖体识别区 b）含有不编码的间隔序列转录终止区：含有高度保守序列AATAAA，该序列与mRNA转录后3端加poly（dA）尾有关2. 基因的特殊排列对于大多数基因来说，基因组中的基因一个接一个排列在DNA分子上，在基因之间存在长度不等的间隔区，但某些生物基因组中的基因存在重叠，重复，加倍和重排等现象1） 基因重叠：一个基因内包含另一个基因的现象 a）部分重叠 ：两个基因的序列部分重叠 b）完全重叠：一个基因完全包含在另一个基因内2）重复基因:在某些生物基因组中，某些基因存在多个拷贝的现象* 真核生物基因组中组蛋白基因3） 加倍基因:同一细胞中至少含有两套完全或基本相同的基因4） 基因重排:在生物的发育过程中，同一基因簇中的基因在不同的细胞中的排列顺序发生改变的现象.它与细胞功能的分化及表达有关.第2节 目的基因的制备(一)目的基因的分离方法根据不同类型基因组的大小、基因组成和基因排列方式不同，采用以下的方法可以把目的基因从基因组中分离出来。1.直接分离法（1）限制性核酸内切酶酶切分离法对已知序列的DNA分子；对已知定位的目的基因；其它DNA分子可与基因组文库相结合；缺点：该方法适于从基因组简单的生物体中分离目的基因，如病毒等（2）物理化学法根据基因片段的碱基组成差异较大，其理化性质，如浮力密度和解链温度等的差异，从生物基因组中分离目的基因。密度梯度离心法、单链酶解法、分子杂交法密度梯度离心法：其原理是GC含量高DNA片段的浮力密度较高，而富含ATDNA片段的浮力密度低，利用密度梯度超速离心技术可以分离GC含量较高的目的基因片段。单链酶解法： GC比AT键稳定，加热后AT较多的先变成单链，用单链特异的S1核酸酶酶切，再经氯化铯超速离心，获得无单链缺口的DNA分子杂交法（Molecular hybridization):ssDNA与其互补的核苷酸序列配对形成dsDNA，这就是分子杂交的原理。2.化学合成法化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。3.基于PCR的分离法PCR法定向扩增目的基因的基本原理PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。（1）直接从基因组中扩增提取基因组DNA作模板根据目的基因序列设计引物PCR扩增（2）从mRNA中扩增: RT-PCR提取基因组 total RNA反转录合成总cDNA作模板根据目的基因序列设计引物PCR扩增（3）同源序列克隆法依据：自然界的长期进化中，一些蛋白质的基因编码序列保持着高度的保守性，在生物的种属之间，基因编码序列有着很高的同源性。方法：根据同源序列设计引物进行PCR扩增，利用PCR产物进行RACE扩增或结合DNA文库进行分离目的基因。4.基于基因文库的分离法（1）核酸杂交法原理： 将基因文库的菌落或噬菌斑原位转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜之后，进行裂解，释放DNA并且固定在膜上，利用特异的核酸探针进行筛选，根据碱基配对原则筛选到目的基因。（2）应用表达文库分离克隆的目的基因（免疫学分离法）当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的探针时，将cDNA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。特点：1）表达的蛋白质以融合蛋白质的形式存在，其中原核蛋白质的氨基酸序列是整合在真核蛋白质的一个末端，不易被原核细胞中的有关蛋白酶消化降解，因而显得比较稳定，可以得到较高的表达水平。2） cDNA片断必须置于启动子序列下游，在其控制之下；按正确的取向和读码结构插入，确保产生正确的蛋白质。筛选的方法： 1）利用抗体筛选表达文库； 2）测定蛋白质的功能； 3）用放射性同位素标记的、带有特定蛋白质结合位点的DNA片断作探针筛选表达文库。二、目的基因的获得（ 一）基因组文库的构建基因文库(gene library)概念又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。按外源DNA片段的来源分基因文库分为：基因组DNA文库：从特定组织提取的染色体基因组DNAcDNA文库：mRNA反转录成的cDNA拷贝基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。目的：a）分离有用的目的 基因b）保存某种生物的全部基因1基因组DNA文库的类型 根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库等）2基因组DNA文库的质量标准重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力。载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆。克隆片段易于从载体分子上完整卸下。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选3基因组DNA文库构建的程序1）载体DNA片段的制备 DNA分离纯化限制酶切 脱磷酸化反应2）供体DNA片段的制备总DNA分离纯化物理切割法超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）或酶切法（内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。 ）分离特定大小DNA片段3）.载体与基因组DNA大片段的连接（1） 粘性末端直接连接：载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端（2）人工接头法（adapter）（3） 同聚物加尾:人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。4）重组DNA转化受体细胞：根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞4基因组文库的大小（必须包括一定数量的重组子才可能克隆基因组中的任何碱基序列。）5DNA文库的保存1）影印膜滤保存法2）.液体培养基中扩增保存方法：从平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混 合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终浓度为25%的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。3）保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合 适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大6基因文库的筛选表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄 二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段（2） cDNA文库构建以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。cDNA文库的特点（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达（一般选用的载体都是表达型的）。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。1cDNA基因文库构建的步骤：细胞总RNA的提取和mRNA的分离第一条cDNA合成第二条cDNA合成双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖1.）总RNA（total RNA）提取和mRNA的分离纯化提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。mRNA的分离纯化（1）原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化，Column（柱），分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。2）cDNA第一链合成：逆转录酶能以RNA为模板合成DNA3） cDNA第二链合成（自身引导法和置换合成法）剩下的cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。去掉发卡结构用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。4） cDNA与载体连接与转化受体细胞基因组DNA文库的优点 相对于cDNA文库，基因组文库的优点： cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列； cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难；从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。 cDNA文库的优点 cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 cDNA文库的筛选比较简单易行。 每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。 cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。 cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能 cDNA克隆的主要的缺点 cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。 cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。 在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。第5章 基因与载体连接1、 黏性末端与平末端的连接一）黏性末端DNA分子间的连接:DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起。 1. 两段DNA的连接 ,依靠粘性末端2. DNA片断与载体的连接:依靠粘性末端3 粘性末端的更换 二) 平末端（blunt end）的连接1. 直接连接:5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。2. 人工加尾形成 “粘性末端”（1）同聚物加尾 法 （2）衔接物(linker)连接（3）DNA接头 (adapter)连接法二、其他连接方式一）PCR产物的连接1. 在引物的5端设计酶切位点（1）设计原则:符合载体的多克隆位点(MCS)；避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。（2）带酶切位点的引物结构:3端1520bp与模板互补； 5端610bp是某个内切酶的识别序列。2. 与T载体直接连接:（1）PCR产物两个3端一般都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3端人为地各加一个T:利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！二）DNA体外连接应注意的事项1插入片断与载体的酶切位点互补：用相同的酶切，用同尾酶切2. DNA插入的方向正确,用双酶切3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确：DNA定向插入，起始密码（防止连接后形成新的起始密码子，造成移码突变)4. 防止载体自身环化连接:提高插入片断的用量,用碱性磷酸酶处理载体第6章 重组DNA导入受体细胞1、 受体细胞:指能够摄取外源DNA（基因）并使其稳定遗传的细胞。作为基因工程的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取外源 DNA(基因)，并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值或理论研究价值的细胞。1受体细胞的选择原则据所用载体体系及受体细胞的基因型进行选择；重组体的转化或转染率高；能够稳定遗传；受体细胞基因型与载体所含的选择标记匹配；易于筛选重组体；外源基因可以高效表达和稳定遗传；此外，安全性、导入方法、翻译及后加工机制和生产应用价值等。2. 受体细胞的类型:微生物表达系统,植物表达系统动物细胞表达系统2、 重组DNA导入受体细胞的途径转化：transfermation，通过生物学或理化方法使质粒DNA或以质粒DNA为载体构建的重组DNA导入受体细胞内，并在受体内稳定维持和表达的过程，主要用于原核生物。转染：transfection，是转化的一种特殊形式，指病毒或以病毒为载体构建的重组DNA导入受体细胞，并使宿主遗传性状发生改变的过程，其中包括DNA、RT-DNA及RNAi，主要用于原核生物。转导:( transduction ) 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。 1. 直接转化法有的微生物细胞在不加任何处理的情况下就能直接摄取外源 DNA，只要外源 DNA与这样的细胞混合，在适宜的条件下悬浮培养，就能完成外源 DNA 的转化。细菌转化 ：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传性改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫给体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株叫受体菌株。 大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。 通常采用的是大肠杆菌的感受态细胞，即在冰浴中用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的大肠杆菌，以获得高效转化的感受态细胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亚矾、二硫苏糖醇(DTT)或用氯化己胺钴处理制备感受态细胞。感受态细胞(competent cell):具有易于接受外源DNA能力的细胞。感受态：是指受体细胞能吸收外源DNA分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。一般受体细胞在对数生长期转化能力最强。2. 化合物诱导转化法:原理：外源 DNA 与多聚物（聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）、 二价阳离子（Mg 、Ca 、Mn等）混合，再与受体细胞或原生质体混合，可使外源 DNA进入细胞。尤以 PEG应用最广，可用于原核生物细胞、动物细胞和植物原生质体的基因转化。3. 高压电穿孔转化法（1）Electroproration原理：利用高压电脉冲作用，使细胞膜上产生可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA和高分子物质进入细胞质内而实现基因转化，但不伤及细胞，切断电场后，被击穿的膜孔可以自行恢复。（2）过程：把宿主细胞置于外加电场中，通过电脉冲作用在细胞膜上打孔，DNA分子进入细胞。4. 微弹轰击转化法（1）原理：金属微粒在外力作用下，达到一定速度后，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随金属颗粒一起进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害而维持正常的生命活动。（2）过程：外源DNA与钨、金等金属微粒混合，使DNA吸附在微粒表面；用基因枪轰击，通过氦气冲击波使DNA随金属微粒进入植物细胞。5. 显微注射法（1）原理：利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核（需用特制的玻璃微管）。（2）过程：将外源基因直接注入实验动物受精卵原核，外源基因整合到动物基因组，通过胚胎移植把含有外源基因的受精卵移植到受体子宫并发育6. 脂质体（liposome）介导法（1）原理：受体细胞的细胞膜表面带负电荷，脂质体颗粒带正电荷，利用引力的作用把遗传物质导入细胞内。即用脂类化学物质包裹DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。脂质体是根据生物膜的结构功能特性合成生物膜，然后把DNA包裹在人工膜内。 （2）过程：在形成脂质体时，把用来转染的目的DNA分子包裹在其中；脂质体与细胞接触；外源DNA分子导入受体细胞。7. 花粉管通道法（1）原理：在花粉管通道形成之后封闭之前一段时间，使外源DNA能沿着花粉管通道进入胚囊，转化尚不具正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞，从而实现基因的转移。（2）适用范围：植物8. 超声波介导转化法（1）原理：利用低音强脉冲超声波的物理作用，可逆性的击穿细胞膜并形成过膜通道，使外源DNA 进入受体细胞。9. 激光微束穿孔转化法 （1）原理：利用直径很小、能量很高的激光微束能引起细胞膜可逆性穿孔的原理。在荧光显微镜下找适合的细胞，然后用激光代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔外于细胞周围的外源DNA分子随之进入受体细胞。10. 病毒颗粒转导法（1）原理：用病毒(噬菌体)DNA(或 RT-DNA)构建的克隆载体或携带目的基因的克隆体，在体外包装成病毒(噬菌体)颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组 DNA 进入受体细胞，将此过程称为病毒(噬菌体)颗粒转导法。11. 磷酸钙转染法:原理：哺乳动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。12. DEAE-葡聚糖转染法即二乙胺乙基葡聚糖法（1）可能机制：DEAE葡聚糖能与外源DNA形成复合物，保护DNA免受核酸降解 DEAE葡聚糖可作用于受体细胞，增加其通透性，便于DNA进入。13. 聚阳离子DMSO转染法（1）原理：采用聚阳离子poly-brene处理哺乳动物细胞，以增加细胞表面对DNA的吸附能力，然后用25%30%DMSO短暂处理细胞，增加膜的通透性，以提高对外源DNA的捕获量14. 农杆菌介导Ti质粒载体转化法（1）原理：植物受伤后，在伤口处分泌大量的酚类物质如乙酰丁香酮AS、羟基乙酰丁香酮等，他们是农杆菌识别敏感植物的信号分子，趋化性农杆菌移向这些细胞，并将其Ti质粒上的T-DNA转移至细胞内部，故目的基因与Ti质粒结合后，通过农杆菌介导转入植物细胞，与染色体DNA整合而得以稳定维持或表达。第7章 聚合酶链反应第1节 PCR基本原理 一、PCR的基本原理由一对引物介导,通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶使引物延伸而成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过2030个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。 （一）DNA模板的解链（变性） 90 95 ，30s 理论上，在90 左右能使DNA双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；且（二）DNA 单链与引物的退火（复性）在中性pH情况下，DNA的完整性仍能很好保存。 55 65 , 3045s 引物与模板单链特异性结合（较高的温度）；不希望两条互补的模板单链结合在一起（DNA引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+模板几率DNA自身复性几率 ）;（3） 引物的延伸（新链DNA的合成） 7075 ，3060s （2kb)首次循环：引物从3端开始延伸，延伸片段的5端为人工合成引物是特定的， 3端没有固定的终止点，长短不一。第二个循环：引物与新链结合，由于后者5端序列是固定的末端，意味着5端的序列就成为此次延伸片段3端的终止点。N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5端的限定，产物的序列是介于两种引物5端之间的区域。引物本身也是新生DNA链的一部分。PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。 第3节 、PCR扩增的基本方法第四节 PCR的优化（一）DNA聚合酶(最关键因素之一) 1、 Taq-DNA聚合酶的热稳定性及最适延伸温度在7080具有最高聚合活性，高温时仍比较稳定。所以7080为其最适延伸温度，则退火和延伸反应温度可提高，限制了非特异性扩增产物的出现，增加了PCR的特异性。2、 Taq-DNA聚合酶的功能：有53聚合酶活性，有53外切酶活性，无35外切酶活性 Taq-DNA聚合酶Taq DNA酶的聚合出错率较高（2.1X10-4），然而通过优化反应条件，可使Taq酶的聚合出错率降低到原来的1/3。 若要细胞克隆PCR扩增的产物，进行表达，扩增后必须测序证实才可使用。 3、 激活剂与抑制剂Taq-DNA聚合酶：其活性需要Mg2+ ，Mg2+的精确浓度主要取决dNTP浓度Mg2+浓度过高导致非特异扩增。一般常用1.5mmol/L（二）引物（寡核苷酸引物）引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物的作用：决定PCR扩增产物的特异性与长度，决定PCR反应的成败。PCR引物的设计一般原则：引物长度一般以1830bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。引物间退火温度相差不要超过5。避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在4060%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。要避免两个引物间特别是3末端碱基序列互补以及同一引物自身3末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C或T时引发效率较高。引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。简并引物：多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。嵌套引物（巢式PCR） ：使DNA序列得到有效的选择性扩增。（三）模板模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。（4） 脱氧三磷酸核苷酸（dNTPs(5） Mg2+Taq酶活性所必需，游离的Mg2+的标准使用范围：0.5 - 10 mM Mg2+的浓度影响扩增产物的特异性、引物退火、引物二聚体的形成、熔点温度、酶的活性和准确性。因此， PCR反应系统的主要优化参数是Mg2+的浓度。特异性的改进：降低Mg2+浓度，但要注意过低的Mg2+浓度又会影响扩增产物的产量有效性的改进：提高Mg2+浓度，但过量Mg2+将导致非特异性扩增(六）PCR的热循环计划PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤（DNA变性、引物退火和反应延伸）而设置变性-退火-延伸三个温度点。双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。退火温度是影响PCR特异性的较重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有模板的长度。特异性的改进：提高退火温度（比建议退火温度提高2-5）；减少退火时间。过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量，只会增加非特异性引物杂交的可能性。循环次数：决定PCR扩增程度，主要取决于模板DNA的浓度，选在2540次之间 第8章 重组体克隆的筛选和鉴定转化子：导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞重组子的鉴定可以从直接和间接两个方面分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同水平进行鉴定。第一节 载体表型选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法1. 原理：pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。2. pBR322抗菌素标记选择：（1）四环素，抑制细菌生长，但不杀死细菌（2）氨苄青霉素抗性基因：产生b-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。（3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。3. 选择过程：（1）四环素抗性插入失活：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程：如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。二、b-半乳糖苷酶显色反应选择法1. 原理：载体上有一段b-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的a片段（氨基端），其上有外源DN