工程菌的知识.doc

基因工程大肠杆菌发酵的研究摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。研究结果表明，每发酵液可得湿菌体，发酵时间从一般的缩短到，、发酵罐都可得重复性的结果。这项发酵工艺研究不仅适用于E.coli各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。关键词基因工程菌,高密度发酵,人干扰素22b ,鲑鱼降钙素,鱼生长激素, K88K99 基因工程疫苗作者：巫爱珍. 孙玉昆.刊名：生物工程学报讨论:含PL 启动子的E. coli 工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。要求细菌在较低的温度(30 ) 发酵增殖,在一定时间内提高菌体密度,然后迅速提高温度诱导目的产物的表达。这类菌表达产物的表达量取决于二个因素:一是在30 发酵过程中尽可能提高菌体密度,二是快速升温诱导,要同时解决这二个问题是较困难的,目前不少基因工程研究室或生产厂对于这类菌的发酵均遇到上述同类的问题,即菌体密度不高和表达量低,他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵体积,显然不是良策,因为含PL 启动子的工程菌在发酵过程中发酵体积越大(5001000L) ,其表达效率愈低,并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。而本文报道的高密度发酵技术能同时解决以上的问题,发酵时间短(约8h) ,菌体密度及表达效率高,生产车间小型化,能节省大量后处理的设备投资、人力、能源、废物废水处理量少,符合发展现代化生产的要求。对于不需温度诱导表达,在30 发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵,当发酵持续6 小时,菌体仍在直线增殖的情况下,如果延长发酵时间,菌体将继续增加。E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性,在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改变,均取得高密度的发酵结果。应用新型的发酵设备及电脑监控来测定发酵过程的碳源、氮源消耗、产酸量、产酸种类、pH、溶氧等等参数,并从中研究这些参数之间可能发生的相互之间的影响或作用等,对于发酵技术和工艺的改进是必要的,但菌体在发酵过程中的增殖周期是较短暂的,例如大肠杆菌每20min 即增殖一代,要将上述这些参数变化规律反馈于控制菌体在发酵过程中的快速增殖,尚难在发酵过程仅6 - 8h 内完成,因而为了快速、直接的监控是以菌体在发酵过程中的生长情况如菌体浓度或菌体湿重等为依据,控制必要的参数才能奏效.3、如何提高E. coli中可溶性蛋白的表达量？在E. coli 中表达的真核细胞蛋白往往形成不可溶的包含体。原因可能包括疏水基团的相互作用，半胱氨酸在E. coli 胞质还原性环境中不能正确形成二硫键。QIAexpress 纯化系统的一个优点就在于包含体中带有6 His标签的蛋白可以在变性剂作用下生成可溶性蛋白，然后用Ni-NTA纯化。如有必要，变性条件下纯化的蛋白可以复性，重新折叠。尽管如此，很多研究者还是发现纯化过程中的复性比较困难。另一个方法是调整表达环境使生成少量的可溶的天然构象的重组蛋白。即使形成了包含体，一些带6His标签的蛋白仍可以在胞质中，这些胞质中的可溶性蛋白可以在天然的非变性的条件下被纯化。如果需要更多的可溶性蛋白，诱导后降低培养温度会有所帮助。培养温度常常直接影响蛋白表达水平和可溶性，降低温度可以降低表达水平从而使可溶性蛋白量增加。另外，也可以在诱导前让培养物达到更高的细胞密度而表达期控制在最短时间。IPTG的浓度可以从1mM降低到0.0005mM，使表达水平降低90%以上。并且，改变宿主菌也可能有效，因为某些菌比其它菌对某些蛋白的耐受性更好，可以生成更高浓度的可溶性蛋白。最后，很多蛋白需要金属协同因子才能够保持其可溶状态，因此在培养物中加入金属盐可能会有帮助。如果不知道蛋白所需的金属协同因子，则有必要测试不同的添加物。需要注意的是一些二价的阳离子会影响蛋白与Ni-NTA的结合。4、如何在使用Ni-NTA纯化蛋白过程中去除富含组氨酸的杂蛋白？在结合试剂与洗脱试剂中加入20mM的咪唑（即使在变性条件下），可以抑制杂蛋白的结合。实验中逐步提高咪唑的浓度，以确定最佳的去除杂蛋白的浓度。过量使用Ni-NTA也会导致非特异性的结合。因此，对应于预期的表达蛋白量来确定合适的结合体系，可以减少非特异蛋白的结合。很多杂蛋白可能是由于非特异的离子作用引起的，因此纯化过程中确保在试剂中加入至少300mM的NaCl。杂蛋白也可能与标签蛋白结合。加入b-ME（到20mM）可以解离杂蛋白与6His标签蛋白间形成的二硫键。这在目标蛋白中包含相对多的半胱氨酸时尤其重要。杂蛋白与6His标签蛋白的非特异性结合也可能是通过疏水作用产生。在洗脱液中加入以下物质可以减少因此而产生的非特异性：非离子洗涤剂（Trion X-100或Tween 20）;30%的乙醇或甘油。注意，不同的蛋白纯化所需加入的最佳浓度不同，需要试验摸索。杂蛋白也可能是截断的标签蛋白。这样的杂蛋白可以用Western Blot技术很容易的识别。通过质粒测序，检查出内部的翻译起始位点或成熟前的终止子。5、Ni-NTA 是否能用于纯化含有内部His标签的蛋白？是的。Ni-NTA可以与His标签结合，无论标签位于蛋白的N端、C端或是内部。需要注意的是，在非变性条件下纯化时，His标签必须充分暴露在蛋白表面以利于充分的纯化。2培养条件2.1营养源高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,需投入几倍于生物量的基质以满足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要7。一般使用的培养基为半合成培养基,培养基各组分的浓度和比例要恰当,过量的营养物质反而会抑制菌体的生长,特别是碳源和氮源的比例。葡萄糖()因细菌利用快且价廉易得,已被广泛用作重组菌高密度发酵的限制性基质。一般浓度控制在10/左右,如果超过20/将会抑制细胞的生长。同时已有人用甘油代替作为细菌生长的碳源,以减少代谢抑制物质乙酸的积累,更易达到重组菌的高密度和外源蛋白的高表达。3-、胰蛋白胨()、酵母提取物()作为氮源有利于细胞的生长。比如,在硅藻类()高密度培养过程中提高十二碳五烯酸的产量时,3-的最佳比例为12.61.3,3-的最佳比例为3211。有些营养物质在高密度培养过程中可以控制细胞的死亡率,曾有报道在非洲绿猴肾成纤维细胞系()培养过程中,加入半乳糖和谷胱甘肽可以阻止细胞程序性死亡8。另外还有实验数据表明,在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提高。比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽()时,在发酵开始和进行12后,各添加2.0/腺苷三磷酸()和9/前体氨基酸,可以使细胞浓度和的产量分别比不添加这两种物质提高24%和1.4倍9。2.2控制条件2.2.1接种量接种量大小的控制对很多细胞培养和代谢物积累都起到重要作用10。接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生长影响较明显。接种量小(0.5%4%)时,比生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量大(8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续生长时间短,自溶也较快,所以接种量一般选择在4%以下11。2.2.2溶氧浓度溶氧浓度是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之一。大肠杆菌的生长代谢过程需要氧气的参与,溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大,溶解氧的浓度过高或过低都会影响细菌的代谢。在高密度发酵过程中,由于菌体密度高,发酵液的摄氧量大,一般通过增大搅拌转速和增加空气流量以增加溶氧量。随着发酵时间的延长,菌体密度迅速增加,溶氧浓度随之下降。因此在高密度发酵的后期,需要维持较高水平的溶氧浓度。目前,提高溶氧量的方法主要有:通入纯氧来提高氧的传递水平,但可能导致局部混合不匀,易使微生物氧中毒;在菌体中克隆具有提高氧传递能力的透明颤藻蛋白()12;培养基中添加22,利用宿主菌的过氧化氢酶分解产生2;提高氧的分压13。2.2.3值稳定的值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。由于外界的值变化会改变菌体细胞内的值,从而影响细菌的代谢反应,进而影响细胞的生物量和基因产物的表达。.发酵时产生的有机酸(主要是乙酸)可导致发酵液的值降低,细胞释放的2溶解于发酵液内与2作用生成的碳酸也会导致发酵液值的降低。在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸和2,可使值显著降低。必须及时调节值使之处于适宜的值范围内,避免值激烈变化对细胞生长和代谢造成的不利影响。菌体生长和产物合成过程中,常用于控制的酸碱有,和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有补充氮源的作用。但有研究发现,4+浓度对大肠杆菌的生长有很大影响,当4+浓度高于170/时会严重抑制大肠杆菌的生长。2.2.4温度培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。较高的温度有利于细菌的高密度发酵,低温培养能提高重组产物的表达量,而且在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量,并可缩短培养周期。但细胞生长的温度突然升高细胞内就会生成某些热激蛋白,以适应变化的环境,外源蛋白相对量降低,给后续的纯化造成困难。如果温度升高的范围不太大,热激蛋白合成的速度会很快下降,恢复正常蛋白的合成。对于采用温度调控基因表达或质粒复制的重组菌,发酵过程一般分为生长和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组蛋白量。2.2.5诱导剂及诱导时间控制乳糖基因()及其衍生的启动子被广泛地应用于重组蛋白在大肠杆菌表达系统中进行表达生产。这类启动子通常都用异丙基 硫代半乳糖苷()作为诱导剂进行外源蛋白的表达,但它成本高,污染环境,因而不适于工业生产。已有人用乳糖代替异丙基 硫代半乳糖苷()做为诱导剂14或者以一定比例混合15,诱导外源蛋白的表达。诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时,外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。2.2.6补料控制重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键在于补料策略,即采用合理的营养流加方式。常用的流加模式5:非反馈补料,反馈补料,其主要工作原理见下表。除了补料技术的影响外,补料培养基成分及补料时间的选择对外源基因的表达也是至关重要的。如在大肠杆菌表达重组绵羊生长激素(-)时,补料培养基的成分就包含有和,并在培养16后进行补料16。3生长抑制因子3.1乙酸的积累以为碳源的大肠杆菌的生长,常伴随着乙酸的分泌,进而影响细胞生长和蛋白表达。乙酸的分泌可以通过维持较低浓度的或补充等来减少合成代谢。当残留的浓度1/和乙酸浓度2/时,不存在大肠杆菌细胞生长的抑制因子17。乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。目前国外已有研究希望通过代谢工程改变重组大肠杆菌的代谢途径,从而降低乙酸的生成。3.22的积累高密度发酵过程中,细菌代谢产物2的积累也会抑制外源蛋白的表达18。因为2对菌体具有直接的毒害作用,而且溶解于发酵液中也会导致值的下降。有报道多变鱼腥藻()19可以利用2为碳源,进行高密度培养,这样可以消除的抑制作用。（5）氮源NH4+浓度对大肠杆菌的生长有很大影响,当NH4+浓度高于170mmol/l时会严重抑