生物化学1第一章蛋白质化学zjg课件

2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 1 第一章蛋白质化学 生物化学 张金国教授 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 2 第一章蛋白质化学 第一节氨基酸的结构和性质第二节蛋白质的结构和性质第三节蛋白质分子结构与功能的关系第四节蛋白质的分离纯化与鉴定第五节蛋白质测序 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 3 早在1878年 恩格斯就在 反杜林论 中指出 生命是蛋白体的存在方式 现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断 第一 蛋白体是生命的物质基础 第二 生命是物质运动的特殊形式 是蛋白体的存在方式 第三 这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢 蛋白质概述 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 4 蛋白质的概念 蛋白质 protein 是一种复杂的有机化合物 旧称 朊 蛋白质是含氮的生物大分子 根据蛋白质的分子组成 结构和功能等方面的特征 将蛋白质定义为生物体中普遍存在的 由氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子 蛋白质的种类繁多 结构复杂 具有特定的生物功能大分子 是表达生物遗传性状的主要物质 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 5 蛋白质的分类1 按分子外形的对称程度 球状蛋白质 溶解性较好 能结晶 占大多数纤维状蛋白质 可溶性 如血纤维蛋白 不溶性 如胶原蛋白 弹性蛋白 角蛋白 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 6 2 按化学组成 简单蛋白 完全由氨基酸构成结合蛋白 蛋白质 非蛋白部分 辅基 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 7 3 按溶解度分 可溶 醇溶 不溶清蛋白 albumin 又称白蛋白 溶于水 如血清清蛋白 乳清蛋白等 球蛋白 globulin 微溶于水 易溶于稀中性盐溶液 如血清球蛋白 肌球蛋白和大豆球蛋白等 精蛋白 protamine 溶于水及酸性溶液 呈碱性 如鱼精蛋白 组蛋白 histone 溶于水及稀酸溶液 呈碱性 如球蛋白 谷蛋白 glutelin 不溶于水 溶于70 80 乙醇 如玉米蛋白 硬蛋白 albuminoid 不溶于水 盐 稀酸 稀碱溶液 如胶原蛋白 毛发 蹄 角及甲壳的角蛋白和丝蛋白 腱 韧带中的弹性蛋白等 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 8 4 按功能分类 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 9 蛋白质的生物学功能 1 催化功能 酶 2 结构成分 结缔组织的胶原蛋白 血管和皮肤的弹性蛋白 膜蛋白 3 物质运输 血红蛋白 Na K ATPase 葡萄糖运输载体 脂蛋白 电子传递体 4 贮藏 卵清蛋白 奶酪蛋白 种子蛋白 5 运动 肌肉收缩的肌球蛋白 肌动蛋白 6 激素功能 胰岛素 甲状腺素 7 防御 抗体 皮肤的角蛋白 血凝蛋白 8 接受 传递信息 受体蛋白 味觉蛋白 9 调节 控制细胞生长 分化 和遗传信息的表达 组蛋白 阻遏蛋白 10 其他功能 毒蛋白 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 10 1 元素组成碳50 氢7 氧23 氮16 硫0 3 微量的磷 铁 铜 碘 锌 钼凯氏定氮 粗蛋白质含量 蛋白氮 6 252 氨基酸组成蛋白质是由20种L 型 氨基酸组成的长链分子 蛋白质的组成 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 11 一 氨基酸的结构 一 结构通式 第一节氨基酸的结构和性质 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 12 氨基酸的种类 1 基本氨基酸 编码的蛋白质氨基酸 组成蛋白质 20种 见P5表1 1 中文 英文名称 三字母代号 注意 21种 硒代半胱氨酸 2 稀有氨基酸 是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来 3 非蛋白质氨基酸 存在于生物体内但不组成蛋白质 约150种 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 13 基本氨基酸中英文名称及缩写代号 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 14 二 立体异构不对称碳原子是与4个不同原子或原于团相连接的碳原子 也叫手性碳原子 用 C 表示 每种氨基酸都有两种立体异构体D 型 L 型 旋光性 左旋 右旋 左旋 右旋 与构型无相关性 蛋白质分子中的氨基酸都是L 氨基酸 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 15 按照R基的化学结构分类1 脂肪族氨基酸可以分为7组 三 氨基酸的分类及其部分生物学活性编码的蛋白质氨基酸 20种 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 16 1 R为脂肪烃基的氨基酸 5种 注意甘氨酸是唯一不含手性碳原子的氨基酸 物旋光性 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 17 2 R中含有羟基的氨基酸 2种 丝氨酸Ser的OH基 pKa 15 在生理条件下不解离 大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在 Ser和Thr的 OH往往与糖链相连 形成糖蛋白 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 18 3 R中含有硫的氨基酸 2 3种 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 19 半胱氨酸 Cys 的R中含巯基 SH 具有两个重要性质 1 在较高pH值条件 巯基离解 2 两个Cys的巯基氧化生成二硫键 生成胱氨酸 易在膀胱 肾 输尿管中形成结石 Cys也经常出现在蛋白质的活性中心 甲硫氨酸 Met 在生物合成中是一种重要的甲基供体 硒代半胱氨酸 selenocysteine SeC 在天然蛋白质中发现的第21种由三联体密码编码的L 氨基酸 主要存在于谷胱甘肽过氧化物酶中 类似于半胱氨酸也可以生成硒胱氨酸 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 20 4 R中含有酸性基团 2种 天冬氨酸 Asp 侧链羧基pKa为3 86 谷氨酸 Glu 侧链羧基pKa为4 25它们是唯一在生理条件下带有负电荷的的两个氨基酸 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 21 5 R中含有酰胺基团 2种 酰胺基中氨基易发生氨基转移反应 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 22 6 R中含碱性基团 3种 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 23 赖氨酸 Lys 侧链氨基的pKa为10 53 生理条件下 Lys侧链带有一个正电荷 NH3 侧链的氨基反应活性增大 精氨酸 Arg 是碱性最强的氨基酸 侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱 与NaOH相当 pKa值为12 48 生理条件下完全质子化 组氨酸 His 是pKa值最接近生理pH值的一种 游离氨基酸中为6 00 在多肽链中为7 35 是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸 是天然的缓冲剂 它往往存在于许多酶的活性中心 在酶的酸碱催化机制中起重要作用 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 24 三者含有苯环 共轭双键 280nm处紫外吸收 Trp吸收最强 Tyr次之 Phe最弱 2 芳香族氨基酸3种 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 25 3 杂环亚氨基酸 1种 脯氨酸Pro是唯一的亚氨基酸 Pro的 亚氨基是环的一部分 因此具有特殊的刚性结构 一般出现在两段 螺旋之间的转角处 Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 26 在蛋白质中非极性aa一般形成蛋白质的疏水核心 不带电何的极性氨基酸的侧链都能与水形成氢键 易溶于水 带电荷的aa和极性aa位于表面 酶的活性中心 His Ser Cys 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 27 稀有氨基酸也称修饰氨基酸 是在蛋白质合成后 由基本氨基酸修饰而来 1 4 羟脯氨酸 2 5 羟赖氨酸这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中 3 6 N 甲基赖氨酸 存在于肌球蛋白中 4 羧基谷氨酸存在于凝血酶原及某些具有结合Ca2 离子功能的蛋白质中 5 Tyr的衍生物 3 5 二碘酪氨酸 甲状腺素 甲状腺蛋白中 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 28 非蛋白质氨基酸约150种 一般为基本氨基酸的衍生物 还有如 氨基酸 氨基酸 氨基酸 D 氨基酸 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 29 必需氨基酸 体内不能合成或合成的量不足 不能满足机体需要 必须从食物中摄取的氨基酸称必需氨基酸 成年人8种 Thr 苏 Val 丙 Leu Ile Phe Trp 色 Lys Met 胱氨酸和酪氨酸 Tyr 在体内可分别由蛋氨酸和苯丙氨酸转变而来 称半必需氨基酸 婴儿期 Arg和His供给不足 是婴儿的必需氨基酸 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 30 二 氨基酸的性质 一 氨基酸的物理性质1 一般物理性质无色晶体 熔点高200 以上 如甘 233 酪 344 味道不同 甜 苦鲜2 氨基酸的旋光性Gly一种构型 无旋光性Thr 苏 和Ile有四种光学异构体 P9图1 11其余17种氨基酸有两种光学异构体 L型 D型 构成蛋白质的氨基酸均属L 型 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 31 3 氨基酸的吸收光谱 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收 但在红外区和远紫外区 220nm 均有光吸收 在近紫外区 220 300nm 只有酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力 苯 Phe 的 max 257nm 酪 Tyr 的 max 275nm 色 Trp 的 max 280nm 摩尔吸收系数 波长 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 32 二 氨基酸的化学性质1 氨基酸两性解离和等电点 1 氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在 晶体熔点高 离子晶格 不是分子晶格 除胱 酪外 AA易溶于水 水溶液中的氨基酸是极性分子 除脯 羟脯外 不溶于非极性溶剂 可用乙醇使氨基酸沉淀析出 2 氨基酸两性解离 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 33 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 34 氨基酸的等电点及其计算氨基酸的等电点 pI 是指氨基酸净电荷为零时溶液中的pH值 在等电点时 氨基酸在电场中既不向正极移动 也不向负极移动 即处于兼性离子状态 氨基酸等电点的计算有三种情况 pK1 COOH pK2 NH3 pKR R基 解离常数 1 中性氨基酸 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 35 pH pI时 氨基酸带负电荷 COOH解离成 COO 向正极移动 pH pI时 氨基酸净电荷为零pH pI时 氨基酸带正电荷 NH2解离成 NH3 向负极移动 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 36 2 与茚三酮反应茚三酮在弱酸中与 氨基酸共热 引起氨基酸的氧化脱氨 脱羧反应 最后 茚三酮与反应产物 氨和还原茚三酮反应 生成蓝紫色物质 max 570nm Pro Hy Pro与直接形成黄色化合物 max 440nm 用分光光度计可以定量测定微量氨基酸 多肽 蛋白质与茚三酮也有此反应 但是肽越大灵敏度越差 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 37 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 38 3 与亚硝酸反应VanSlyke法测定氨基酸 在标准条件下测定生成的氮气 即可计算出参与反应的氨基酸量 此法可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 39 4 氨基酸的与醛类反应生成西佛碱 Schiff 西佛碱是某些酶促反应的中间产物 如转氨基反应的中间产物 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 40 氨基酸的与甲醛反应氨基酸的甲醛滴定是测定氨基酸含量的一种常用方法 当溶液中存在1mol L甲醛时 滴定终点由pH 12移至pH 9 酚酞指示剂的变色区域 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 41 5 与2 4一二硝基氟苯的反应Sanger反应2 4一二硝基氟苯 DNFB DNP 氨基酸 黄色 层析法鉴定 被Sanger用来测定多肽 蛋白质的NH2末端氨基酸 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 42 6 与异硫氰酸苯酯 PITC 反应 生成苯乙内酰硫脲衍生物 PTH 氨基酸 无色 可以用层析法分离鉴定 Edman 瑞典 用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 43 7 与酰化试剂反应苄氧甲酰氯 苯甲氧甲酰氯 carbobenzyloxychloride Cbz cl 叔丁氧甲酰氯对 甲苯磺酰氯邻苯二甲酸酐丹磺酰氯多肽的人工合成中被用作氨基保护剂 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 44 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 45 丹磺酰氯 DNS Cl 5 二甲基氨基萘 1 磺酰氯 常用于多肽链 NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定 NGly Ala Ser Leu PheC DNS Gly Ala Ser Leu PheC水解DNS Gly Ala Ser Leu PheDNS AA在紫外光激发后发黄色荧光 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 46 8 成盐 成酯反应 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 47 9 成肽反应 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 48 三 氨基酸的分离和分析鉴定 层析法 是利用被分离样品混合物中各组分的化学性质的差异 使各组分以不同程度分布在两个相 固定相 流动相 中 当流动相流进固定相时 由于各组分在两相中的分配情况不同 或电荷分布不同 离子亲和力不同等 而以不同的速度前进 从而达到分离的目的 常见的层析法有 纸层析 薄层层析 离子交换层析 气相层析 高效液相层析 亲和层析 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 49 一 纸层析 用滤纸作为支持物进行层析的方法 是分配层析的一种 原理是 1 在纸上水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相 当有机相沿纸流动经过层析点时 层析点上溶质就在水相和有机相之间进行分配 溶质中各组分的分配系数不同 移动速率也不同 因而可以彼此分开 2 氨基酸与茚三酮的显色反应 3 物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用Rf 比移值 来表示 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 50 4 Rf值 比移值 的大小与物质的结构 性质 溶剂系统 PH层析滤纸的质量和层析温度等因素有关 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 51 纸层析 单向纸层析图 Rf值 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 52 双向纸层析图 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 53 二 离子交换层析法 用离子交换树脂作为支持剂的层析法 各种氨基酸分子的结构不同 在同一pH时与离子交换树脂的亲和力有差异 因此可依据亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来 达到分离的效果 这种分离主要与各种离子所带电荷有关 在电荷相同时 与极性 非极性有关 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 54 离子交换树脂 化学本质 是一种人工合成的聚苯乙烯 苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物 阳离子交换树脂 活性基团是酸性的 如磺酸基 SO3H 强酸型 羧基 COOH 弱酸型 阴离子交换树脂 活性基团是碱性的 如季胺基 N CH3 3OH 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 55 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 56 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 57 全自动氨基酸分析仪仪器原理 阳离子交换分离 茚三酮柱后衍生法主要用途 多用于水解蛋白分析 如饲料 农产品等 也可以用于游离氨基酸的分析 如血清 尿液 组织液 植物提取液等代表厂家 德国sykam 日本hitachi 日立 北京温分仪器厂等 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 58 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 59 氨基酸与树脂上解离基团之间的静电引力氨基酸与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 60 一 肽1 肽键和肽平面肽 一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物 其中的氨基酸单位称氨基酸残基 肽键 氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键 酰氨键 第二节蛋白质的结构和性质 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 61 肽键中的C N单键长度为0 132nm 一般的C N单键长度为0 147nm C N双键为0 127nm 因此肽键中的C N键具有40 双键的性质 不能旋转 与相邻的4个原子构成共振平面 即肽平面 酰胺平面 也称肽单位 肽单位间以 C原子相隔 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 62 多肽链可以看成由aa串联起来的无数个酰胺平面组成 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 63 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 64 2 肽的命名及结构一个肽可根据其所含的氨基酸残基数简单地称为二肽 三肽 四肽等 10个氨基酸以下称为寡肽 10个以上多肽 肽的命名是从肽链的N末端 游离氨基 开始 到C末端 游离羧基 按照氨基酸残基的顺序逐一命名 例如 由丝氨酸 甘氨酸 酪氨酸 丙氨酸和亮氨酸组成的五肽就命名为丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸 结构简写 N末端写在左边 C末端写在右边 即从N C 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 65 3 肽的性质 1 旋光性一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和 2 肽的酸碱性质短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在 肽的酸碱性质主要取决于 端 和 端 COOH以及侧链 上可解离的基团 在长肽或蛋白质中 可解离的基团主要是侧链基团 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 66 3 肽的化学反应肽的 羧基 氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应 双缩脲反应在碱性溶液 NaOH 中 双缩脲 H2NOC NH CONH2 能与铜离子 Cu2 作用 形成紫色络合物 凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应 可用于定量分析 双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应 游离氨基酸无此反应 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 67 4 天然存在的活性肽 1 谷胱甘肽谷胱甘肽在体内的氧化还原反应过程中起重要作用 清除内源性过氧化物和自由基 维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 68 2 催产素和升压素 九肽激素 催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩 有催产及使乳腺排乳的作用 升压素使血管平滑肌收缩 从而使血压升高 减少排尿的作用 也称抗利尿激素 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 69 3 抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽 青霉素 Benzylpenicillin Penicillin 又被称为青霉素G 盘尼西林 青霉素钠 苄青霉素钠 青霉素钾 苄青霉素钾 青霉素是抗菌素的一种 是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷 能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素 是第一个能够治疗人类疾病的抗生素 青霉素类抗生素属 内酰胺类抗生素 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 70 4 脑肽有镇痛作用而又不会像吗啡 使病人成瘾的药物 中科院上海生化所1982年利用蛋白质工程技术成功地合成Leu 脑啡肽 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 71 5 胆囊收缩素由33个氨基酸组成 6 胰高血糖素胰脏 细胞分泌 它含有29个氨基酸残基 胰高血糠素可调节控制肝糖原降解产生葡萄糖 以维持血施水平 还能引起血管疏张 抑制肠的蠕动及分泌 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 72 蛋白质是由一条或多条多肽 polypeptide 链以特殊方式结合而成的生物大分子 蛋白质与多肽并无严格的界线 通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质 蛋白质分子量变化范围很大 从大约6000到100万道尔顿甚至更大 二 蛋白质的分子结构概述 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 73 二 蛋白质的构象和蛋白质结构的组织层次 每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或称三维结构 这种三维结构通常被称为蛋白质的构象 为了表示蛋白质结构的不同组织层次 一般采用下列专门术语 一级结构 primarystructure 二级结构 secondarystructure 三级结构 tertiarystructure 四级结构 quarternarystructure 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 74 蛋白质结构层次 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 75 三 蛋白质的一级结构 共价结构 1 概念蛋白质分子中氨基酸残基的种类 数量 连接方式和排列顺序称为一级结构 是蛋白质的基本结构 它是由基因 遗传信息 遗传密码 决定的 涉及的化学键是肽键和少量的二硫键 从分子水平上研究蛋白质的结构和功能 为蛋白质的人工合成奠定了物质基础 诊断遗传病 合成基因探针等高新技术的研究具有重要意义 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 76 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 77 二级结构 是多肽主链本身在空间的排列 或规则的几何走向 折叠和盘绕的方式 不涉及侧链的结构 氢键等次级键是维持二级结构稳定的作用力 蛋白质的二级结构单位 主要有 螺旋 折叠 转角 无规卷曲等 四 蛋白质的二级结构 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 78 一 螺旋结构 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 79 蛋白质 螺旋结构 右手螺旋 顺时针 肽链的主链形成紧密的螺旋 侧链伸向外侧 每一圈包含3 6个氨基酸残基 每个残基跨距为0 15nm 螺旋上升一圈的距离 螺距 为3 6 0 15 0 54nm 环内原子数13 螺旋通过氢键维持稳定 第一个肽键的NH和第四个肽键的CO形成氢键 第n个肽键的NH和第n 3个肽键的CO形成氢键 氢键取向与主轴基本平行 螺旋结构形成的限制因素凡是有Pro存在的地方 不能形成 因Pro形成的肽键N原子上没有H 不能形成氢键 静电斥力 若一段肽链有多个Glu或Asp相邻 则因pH 7 0时都带负电荷 防碍 螺旋的形成 同样多个碱性氨基酸残基在一段肽段内 正电荷相斥 也防碍 螺旋的形成 位阻 如Asn Leu侧链很大 防碍 螺旋的形成 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 80 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 81 蛋白质 折叠结构 二 折迭又叫 折迭片或 片层结构 也是蛋白质分子中常见的主链构象之一 所谓 折迭是两条或两条以上充分伸展成锯齿状折迭构象的肤链侧向聚集 按肽链的长轴方向平行并列 形成的折扇状构象 折迭构象靠相邻肽链主链亚氨基 NH 和羰基氧原子之间形成有规律的氢键联结维系 平行式 N端 N端 平行式与反平行式 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 82 三 蛋白质的 转角结构 又叫U型回折 转弯或发夹结构 是近年来在球状蛋白质分子中发现的一种主链构象 球状蛋白质分子主链在盘曲折迭运行中往往发生180 的急转弯 这种回折部位的构象即所谓 转角 转角是由4个连续的残基组成的 第一个残基的羰基与第四个残基的亚氨基间形成氢键联结 稳定构象 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 83 二级结构的多元性 球状蛋白质分子的二级结构一般都不是单一构象 主链的不同段落构象不同 多种构象单元交替连接组成整条肽链的二级构象 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 84 超二级结构 由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 85 五 蛋白质的三级结构 一 概念三级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕 折叠 形成的包括主链和侧链构象在内的特定空间结构 也指多肽链中所有原子和基团的构象 也包括所有主链和侧链的结构 三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的氢键 疏水键 范德华力和静电作用维持的 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 86 二 结构域 大的球蛋白分子中 多肽链形成几个紧密的球状构象 彼此以松散的肽链相连 此球状构象是结构域 结构域是多肽链的独立折叠单位 一般由100 200个氨基酸残基构成 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 87 结构域 有些较大的球状蛋白质分子或亚基 常常先由几个二级结构单元组合在一起形成超二级结构 以此作为形成三级结构的实体 这些超二级结构实体称为结构域 又叫辖区 结构域进一步缔合则形成近似球形的三级结构 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 88 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 89 蛋白质的三级结构 蛋白质分子在一 二级结构基础上 再进行三维空间的多向性盘曲折迭 形成特定的近似球状的构象 称为蛋白质分子的三级结构 三级结构包括蛋白质分子主链和侧链所有原子或原子团的空间排布关系 蛋白质三级结构的构象特点 1 三级结构构象近似球形 2 分子中的亲水基团相对集中在球形分子的表面 疏水基团相对集中在分子内部 形成所谓 亲水表面 疏水核 3 三级结构构象的稳定性主要靠疏水相互作用维系 亲水表面能吸附形成厚厚的水化膜和双电层 对蛋出质分子构象起很好的保护作用 4 三级结构形成之后 蛋白质分子的生物活性部位就形成了 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 90 六 蛋白质四级结构 一 概念由两条或多条具有三级结构的多肽链通过次级键缔合形成的聚集体称为蛋白质的四级结构 其中每一个具有三级结构的多肽链单位称为亚基 subunit 蛋白质的四级结构包括亚基的种类 数目及各个亚基在寡聚蛋白中的空间排布和亚基之间的互相作用 但不涉及亚基内部结构 蛋白质亚基之间主要通过疏水作用 氢键 范德华力等作用力形成四级结构 其中最主要的是疏水作用 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 91 蛋白质分子的亚基数目一般为偶数 大多数蛋白质含2个或4个亚基 亚基可以是相同的或不同 由两个或两个以上亚基组成的蛋白质称为寡聚蛋白质 无四级结构的蛋白质称为单体蛋白质 二 亚基与蛋白质生物活性的关系亚基单独存在时无生物活性 只有相互聚合成特定构象时才有完整的生物活性 如血红蛋白是由4个亚基构成的四聚体 其中两个 亚基 两个 亚基 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 92 蛋白质的四级结构 有些球状蛋白质分子是由两个或两个以上的三级结构单位缔合而织成的 通常称为寡聚蛋白 寡聚蛋白分子中的每个三级结构单位称为一个亚基 或亚单位 所谓蛋白质分子的四级结构就是指寡聚蛋白质分子中亚基与亚基间的立体排布及相互作用关系 亚基的数目和类型也属四级结构研究的内容 但不涉及亚基本身的构象 两个亚基的结构 血红蛋白 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 93 寡聚蛋白质分子的亚基组成 据统计 已经研究过的寡聚蛋白质分子达700多种 它们的亚基数目差别很大 少则几个 多则十几个 数十个 大多数寡聚蛋白质是由偶数亚基组成的 其中 两个或四个亚基者最多 奇数亚基的分子很少见 亚基类别组成有两种类型 一种是由相同亚基组成的均一寡聚蛋白 如过氧化氢酶 是由四个相同亚其组成的四聚体 每个亚基的一 二 三级结构都相同 功能也相同 另一种是由结构不同的亚基组成的非均 寡聚蛋白 如血红蛋白 2 2 维持四级结构稳定的因素为各亚基之间的作用力如氢键 离子键 疏水键 含有四级结构的蛋白质 单独的亚基一般没有生物学功能 只有完整的四级结构才有生物学功能 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 94 蛋白质的一 二 三 四级结构 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 95 三 维系蛋白质分子构象的作用力 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 96 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 97 一 蛋白质的相对分子量测分子量的方法 化学组成法测定最低分子量超速离心法分子筛层析法SDS PAGE法沉降系数法沉降平衡法 七 蛋白质的性质 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 98 二 蛋白质的旋光性蛋白质分子的旋光性是由构成他的各种氨基酸旋光度和 螺旋结构所决定的 通常蛋白质溶液是右旋的 但变性后螺旋结构松开 其左旋性增大 利用这一性质可推算蛋白质分子中 螺旋结构的百分含量 三 蛋白质的紫外光吸收大多数蛋白质含有酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸 因此蛋白质在280nm有最大光吸收 利用这一性质可用紫外分光光度法测定溶液中蛋白质的含量 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 99 等电点 中性盐 Ca2 Mg2 Cl HPO42 影响滴定曲线形状和等电点 盐离子浓度为0时的等电点称等离子点 四 蛋白质的两性电离和等电点 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 100 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 101 五 蛋白质的胶体性质蛋白质分子直径在1 100nm之间 在水溶液中具有胶体溶液的通性 布朗运动 丁达耳现象 不能通过半透膜 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 蛋白质表面极性基团形成的水化膜 非等电状态时 同种电荷的互相排斥 质点大小在1 100nm 可以进行布郎运动 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 102 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 103 六 蛋白质的沉淀作用 盐析法 大量的中性盐 NH4 2SO4 Na2SO4 NaCl 使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀 有机溶剂沉淀法 破坏水化膜 降低介电常数 PEG 丙酮 乙醇等 重金属盐沉淀 pH pI时带负电荷 与重金属离子 Hg2 Pb2 Cu2 等 结成不溶性沉淀 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 pH小于等电时 蛋白质带正电荷 易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀 生物碱试剂 单宁酸 苦味酸 钨酸 酸类 三氯乙酸 磺基水杨酸 加热变性沉淀 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 104 七 蛋白质的变性 1 天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下 其特定的空间结构被破坏 从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失 如酶失去催化活力 激素丧失活性称之为蛋白质的变性作用 蛋白质的变性是很复杂的 如果有化学键的断裂和生成就是化学变化 如果没有化学键的断裂和生成就是物理变化 变性蛋白质只有空间构象的破坏 一般认为蛋白质变性本质是次级键 二硫键的破坏 并不涉及一级结构的变化 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 105 2 蛋白质变性后 往往出现下列现象 生物活性丧失 硫水基团外露 分子结构伸展松散 易被蛋白酶水解 溶解度降低 沉淀 粘度增加 制备活性蛋白质时严防蛋白质变性 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 106 3 变性的因素 强酸和强碱 有机溶剂 破坏疏水作用 去污剂 去污剂都是两亲分子 破坏疏水作用 还原性试剂 尿素 硫基乙醇 盐浓度 盐析 盐溶 重金属离子 Hg2 pb2 能与 SH或带电基团反应 温度 机械力 如搅拌和研磨中的气泡 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 107 4 可逆变性与不可逆变性变性并非都是不可逆的变化 当变性程度较轻时 如去除变性因素 有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能 变性的可逆变化称为复性 例如 核糖核酸酶中四对二硫键及其氢键 在 巯基乙醇和8M尿素作用下 发生变性 失去生物学活性 变性后如经过透析去除尿素 巯基乙醇 并设法使巯基氧化成二硫键 酶蛋白又可恢复其原来的构象 生物学活性也几乎全部恢复 此称变性核糖核酸酶的复性 许多蛋白质变性时被破坏严重 不能恢复 称为不可逆性变性 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 108 牛核糖核酸酶的一级结构 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 109 天然状态 有催化活性 尿素 巯基乙醇 去除尿素 巯基乙醇 非折叠状态 无活性 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 110 八 蛋白质的颜色反应 1 双缩脲反应尿素加热至180 左右生成双缩脲并放出一分子氨 双缩脲在碱性环境中能与Cu2 结合生成紫红色化合物 此反应称为双缩脲反应 蛋白质分子中有肽键 其结构与双缩脲相似 也能发生此反应 可用于蛋白质的定性或定量测定 一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双纳脲反应 但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 111 2 酚试剂 福林试剂 反应 酚试剂 福林Folin 蛋白质分子一般都含有酪氨酸Tyr 而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 112 3 黄色反应含有酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸的蛋白质与浓硝酸混合加热后呈现黄色的反应 反应原理是硝酸对苯环发生硝化作用 生成黄色的芳香硝基化合物 使蛋白质发生变性 浓硝酸滴到皮肤上 过一段时间皮肤就会发黄 数天后死皮褪去 就是因为这个原因 生成的黄色冷却后 若再与碱或氨水接触 则颜色转变为橙黄色 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 113 4 米伦氏反应 酪氨酸Tyr及含Tyr的蛋白质米伦试剂为硝酸汞 亚硝酸汞 硝酸和亚硝酸的混合液 蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀 加热后沉淀变成红色 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 114 5 乙醛酸反应 色氨酸Trp及含Trp的蛋白质在蛋白质溶液中加入乙醛酸 并沿试管壁慢慢注入浓硫酸 在两液层之间就会出现紫色环 凡含有吲哚基的化合物都有这一反应 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 115 6 坂口反应 Arg及含Arg的蛋白质精氨酸分子中含有胍基 能与次氯酸钠 或次溴酸钠 及 萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 116 一 一级结构与功能的关系 一 一级结构决定高级结构例 镰刀形红细胞贫血由于病人的血红蛋白分子 用Hb S表示 与正常人的血红蛋白 Hb A表示 相比 在574个氨基酸中只有两个氨基酸的差异而引起的 正常人的Hb A的 链第6位为谷氨酸 而Hb S的 链的第6位为缬氨酸 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病 称为 分子病 12345678 Hb AValHisLeuThrProGluGluLys Hb SValHisLeuThrProValGluLys 第三节蛋白质结构与功能的关系 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 117 Sickle celldisease 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 118 二 同功能蛋白质中氨基酸顺序的种属差异目前对不同机体中表现同一功能的蛋白质的氨基酸排列顺序进较详细的比较研究 发现种属差异是十分明显的 例如 不同生物与人的细胞色素C相差的氨基酸残基数目 可以根据它们在结构上的差异程度断定它们在亲缘关系上的远近 从而出生物进化的研究提供有价值的根据 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 119 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 120 一 肌红蛋白是哺乳动物肌肉中运载氧和贮氧的蛋白质 由一条多肽链 153个氨基酸残基 和一个亚铁血红素辅基组成 空间结构呈紧密球形 氨基酸疏水侧链位于分子内部 极性氨基酸分布在分子表面 内部形成一口袋形空穴 血红素居于此空穴中 血红素是铁卟啉化合物 血红素的Fe2 与4个吡咯环的氮原子形成配位键 另2个配位键1个与93位组氨酸结合 1个与O2结合 故血红素在此空穴中保持稳定位置 二 蛋白质空间结构与功能的关系 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 121 1957年Kendrew 通过X射线衍射测定鲸肌红蛋白的空间结构 由8段 螺旋构成一个球状结构 拐弯处为1 8个残基组成的松散肽链 Pro等常存在于拐弯处 是一个致密结实的球状分子 其分子内部只有一个能容纳4个H2O分子的小空间 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 122 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 123 二 血红蛋白 血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质 1 血红蛋白的结构人体内的血红蛋白由四个亚基构成 分别为两个 亚基和两个 亚基 和 都类似于肌红蛋白 只是肽链稍短 亚基为141aa 亚基为146aa 血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成 肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形 把血红素分子抱在里面 这条肽链盘绕成的球形结构又称为珠蛋白 珠蛋白肽链中第8位的一个组氨酸残基中的吲哚侧链上的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合 当血红蛋白不与氧结合的时候 有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合 而当血红蛋白载氧的时候 就由氧分子顶替水的位置 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 124 血红蛋白的结构 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 125 2 氧合作用血红蛋白与氧结合的过程首先一个O2与血红蛋白四个亚基中的一个结合 与氧结合之后的珠蛋白结构发生变化 造成整个血红蛋白结构的变化 这种变化使得第二个O2相比于第一个O2更容易与另一个亚基结合 而它的结合会进一步促进第三个氧分子的结合 以此类推直到构成血红蛋白的四个亚基分别与四个氧分子结合 而在组织内释放氧的过程也是这样 一个氧分子的离去会刺激另一个的离去 直到完全释放所有的氧分子 这种现象称为协同效应 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 126 3 别构效应 在生物体内 当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合 触发蛋白质的构象发生变化 从而导致蛋白质功能活性改变的现象称为别构效应 allostericeffect 又称为变构效应 某些含多个亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象 性质和功能发生改变 血红蛋白是一个别构蛋白 受到波尔效应 H 和CO2 和别构效应 2 3 二磷酸甘油酸 的显著影响 其氧合曲线表现为S型曲线 注意 CO的毒性作用 空气中0 1 导致窒息死亡 CO与血红蛋白的结合力是氧的250倍 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 127 肌红蛋白 Mb 和血红蛋白 Hb 的氧结合曲线 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 128 一 蛋白质分离纯化的一般原则纯化的实质增加制品 preparation 的纯度或比活力蛋白质分离纯化的一般程序 1 前处理 抽提2 粗分级3 细分离4 浓缩结晶5 保存 第四节蛋白质分离纯化与鉴定 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 129 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 130 1 前处理 将组织和细胞破碎动物组织和细胞 电动捣碎机 waringblender 匀浆器 homogenizer 超声波处理 ultrasonication 植物组织和细胞 石英砂 提取液 研磨纤维素酶处理细菌 超声波震荡 与砂研磨 高压挤压 溶菌酶处 分解肽聚糖 差速离心法收集细胞的某一组分 如果提取膜蛋白 超声波或去污剂使膜解聚 然后用适当的介质提取 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 131 2 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲溶液把蛋白质提取出来 3 粗分级一般用选择性沉淀法 NH4 2SO4分级沉淀法 盐析 等电点选择性沉淀法 有机溶剂分级沉淀法 热处理选择性沉淀法 生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 132 4 细分离 透析除盐 sephdexG 25凝胶过滤除盐层析法 凝胶过滤层析 离子交换层析 吸附层析 亲和层析 疏水层析 反相HPLC 电泳法 自由界面电泳 区带电泳 凝胶电泳 滤纸和薄膜电泳 粉末电泳 细丝电泳等 盘状电泳 等电聚焦 双向电泳密度梯度离心 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 133 5 浓缩晶体与保存浓缩方法 真空冷冻干燥法 蛋白质几乎无变性 保存方法 晶体保存 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯 能否结晶不仅是纯度的一个指标 也是判断制品是否有活性的指标 纯度越高 溶液越浓 越容易结晶 结晶方法 使溶液略处于过饱和状态 降低温度 盐析 加有机溶剂 调节pH 接入晶种 冻干粉保存 溶液保存 加入抗冻剂 50 甘油 后 20 70 保存 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 134 二 混合蛋白质分离纯化的方法 一 根据分子大小分离 二 根据电荷差异分离 三 根据蛋白质的溶解度分离 四 根据配体特性异性分离 亲和层析 选择性吸附分离 物理吸附 根据疏水性的差异 2020 2 27 ZhangJG Biochemistry 135 一 根据分子大小和形状的差异 1 凝胶过滤法凝胶过滤层析利用一定大小孔隙的具有网状结构的凝胶作层析介质 如葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶等 根据被分离物质的分子大小 形状不同扩散到凝胶孔隙内的速度不同 因而通过层析柱的快慢不同而分离的一种层析法 也称分子排阻层析 分子筛 优点 操作方便 所需设备简单 缺点 分辨率低 分离操作