微生物(酵母)的培养基优化.doc

实验一 微生物(酵母)的培养基优化(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一实验目的：掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。 二实验原理 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。三仪器与试剂 全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。试剂为葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、KH2PO4。四实验方法 (1)、培养基的配制(见表1,2) 表1 正交表试验设计 因素水平 葡萄糖 蔗糖 酵母膏 KH2PO4 1 1.0 0.0 0.5 0.5 2 2.0 1.0 1.0 1.0 3 3.0 2.0 2.0 2.0 表2 正交表实验方案 编号葡萄糖 (A) 蔗糖 (B) 酵母膏 (C) KH2PO4 （D） 生物量 （OD）0h 12h24h36h48h60h1 (1) (1) (1) (1) 2 (1) (2) (2) (2) 3 (1) (3) (3) (3) 4 (2) (1) (2) (3) 5 (2) (2) (3) (1) 6 (2) (3) (1) (2) 7 (3) (1) (3) (2) 8 (3) (2) (1) (3) 9 (3) (3) (2) (1) （2）将上述培养基配制好以后，每250 ml三角瓶装入培养基100 ml，于121下灭菌30 min，冷却。（3）冷却后接种（接种量为5），置于28培养箱进行培养。（4）测OD值：将接种0 h、 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h不同时间的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 五思考题 (1)比浊计数在生产实践中有何应用价值? (2)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的OD值，你将如何选择波长?实验二 紫外线的诱变育种 (指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。二基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。三菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)； 仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四操作步骤（1）菌悬液的制备（a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面45支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。（b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤23次，最后制成菌悬液。（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55左右时倒平板，凝固后待用。（3）紫外线处理（a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。（b）取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。（c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。(4) 稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。(5)涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液01ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。(6)培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。(7)计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。(8)观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在56个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。五实验结果1结果将实验结果填入下表。稀释倍数平均菌落处理时间 （数/皿）诱变剂 （min）10-410-510-6存活率%致死率%紫外线（UV）0（对照）13结果处理透明圈和菌落直径大小（）及其HC比值123456透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值UV处理对照六思考题 (1) 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？(2) 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？实验三 玉米淀粉液化及糖化(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一、 实验目的掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法。掌握粗淀粉含量和还原糖的化学测定方法。二、 实验原理发酵过程中，有些微生物不能直接利用淀粉，因此，当以淀粉为原料时，必须先将淀粉水解成葡萄糖，才能供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，所制得的糖液称为淀粉水解糖。发酵生产中，淀粉水解糖液的质量，与生产菌的生长速度及产物的积累直接相关。 可以用来制备淀粉水解糖的原料主要有薯类(木薯、甘薯)淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等，根据原料淀粉的性质及采用的水解催化剂的不同，水解淀粉为葡萄糖的方法可分为酸解法、酸酶结合法和酶解法。实验室中常采用酶解法制备淀粉水解糖。 酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两步：第l步是利用-淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第2步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。2.1 酶法液化原理淀粉的酶法液化是以-淀粉酶为催化剂，该酶作用于淀粉的-1,4糖苷键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到-淀粉酶的作用后，其碘色反应发生如下变化：蓝紫红浅红不显色(即碘原色)。酶法液化以生产工艺不同分为间歇法，半连续和连续式；液化设备有：管式、罐式、喷射式。加酶方法有：一次加酶、二次加酶、三次加酶。根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法、或中温酶和高温酶混合法。本实验采用：高温酶法，间歇式，罐式，二次加酶法。2.2 酶法糖化原理淀粉的糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非还原末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉的-1，4糖苷键或-1，6糖苷键。因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中，水参与反应，故糖化的理论收率为111.1。（C6H10O5)n+H2O nC6H12O6 162 18 180淀粉糖化实际收率：实际收率的计算公式：淀粉转化率：淀粉-葡萄糖转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。淀粉转化率的计算：DE值：用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度。糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占干物质的百分比称为DE值。DE值计算：还原糖用DNS法测定，浓度表示：葡萄糖g/100ml糖液；干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物质g/100g糖液。影响DE值的因素：糖化时间：最初糖化时，糖化速度快，DE值显著上升；但24h后，当DE值达到90以上时，糖化速度显著放慢。液化DE值与糖化DE值的关系：液化程度应控制适当，太低或太高均不利。原因是液化程度低，则粘度大，难操作；同时，由于液化程度低，底物分子少，水解机会少，影响糖化速度；液化程度低，易发生老化；但液化超过一定程度，则不利于糖化酶与糊精生成络合结构，影响催化效率，造成糖化液的最终DE值低。故应在碘试本色的前提下，液化DE值越低，则糖化液的最高DE值越高。一般液化DE值应控制在12-18。酶制剂用量与糖液DE值的关系：糖化时间与糖化酶用量关系表糖化时间（h）68101624324872糖化酶用量（U/g淀粉）480400320240180150120100为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短糖化时间。但酶用量太高，反而使复合反应严重，最终导致葡萄糖值降低。在实际生产中，应充分利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间，减少糖化酶用量。糖化酶参考用量：液化DE值17，淀粉乳33，60，pH4.5，酶制剂240U/g绝干淀粉。糖化时间16h。三、 实验仪器、设备和材料（1）25升罐 ；（2）小型板框过滤机压滤；（3）烘箱；（4）水桶；（5）量筒；（6）分光光度计；（7）水浴锅；（8）滴定管；（9）电炉；（10）白瓷板；（11）三角瓶；（12）阿贝折光仪；（13）玉米粉；（14）高温-淀粉酶；（15）糖化酶；（16）pH试纸；四、实验方法4.1 淀粉的液化配制30的淀粉乳（按15升配制），调节pH值至6.5，加入氯化钙(对固形物0.2)，加入液化酶(12-20U/g淀粉)，在剧烈搅拌下，先加热至72，保温15min，再加热至90，并维持30min，以达到所需的液化程度(DE值：15-18)，碘反应呈棕红色。液化结束后，再升温至120，保持5-8min，以凝聚蛋白质，改进过滤。4.2 淀粉的糖化液化结束后，迅速将料液用烟酸将pH调至4.2-4.5，同时迅速降温至60。加入糖化酶，60保温若干小时后，当用无水酒精检验无糊精存在时。将料液pH调至4.8-5.0，同时，将料液加热至80，保温20min然后将料液温度降至60-70，开始过滤。4.3 过滤在发酵罐内将料液冷却至60-70；洗净板框过滤机，装好滤布；接好板框压滤机的管道；泵料过滤；热水洗涤(60-70)；空气吹干；过滤结束后，洗净过滤机及有关设备。量取糖液体积；取样分析还原糖浓度。五、数据处理在详细记录实验数据的基础上完成实验报告。计算淀粉转化率。六、 实验结果和讨论糖化酶用量及糖化时间对糖化效果的影响；液化和糖化时温度及pH对实验效果的影响。附录11、残糖含量测定3,5-二硝基水杨酸比色定糖法一、原理：本实验是利用3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物在一定范围内还原糖的量和棕红包物质颜色深浅的程度成定比例关系可用于比色测定。葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸试剂反应生成的有色物质在520 nm处有最大吸收峰，故在此波长下进行比色。二、实验步骤：1 标准曲线制作取6支大试管，从05分别编号，按下表加入各种试剂。试剂管 号0123451mg/mL葡萄糖溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20DNS试剂（mL）0.50.50.50.50.50.5将各管溶液振荡混匀后，在沸水浴中准确煮沸5 min，取出迅速用冷水冷却至室温，加入蒸馏水15 mL，摇匀。在520 nm波长下，用空白调零测定吸光值，测定吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。2 样品测定取培养基5 mL，5000 r/min离心5 min，取上清液1 mL于试管中，加入0.5 mL DNS试剂，同以上操作，测吸光值，用Origin软件绘制标准曲线，并求出各个时期样品的葡萄糖含量。实验四 淀粉酶的固定化生产(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员:张继泰)一、实验目的：学习细胞固定化的原理，通过海藻酸钠包埋固定产淀粉酶的枯草芽孢杆菌，掌握菌体包埋固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中的应用。 二、 实验原理：细胞固定化克服了传统游离细胞发酵的不足，本实验以海藻酸钠为载体，以CaCl2为交联剂，进行固定化枯草芽孢杆菌。海藻酸钠是从海藻提取获取的藻酸盐，为D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性共聚物，多价阳离子（如Ca2+）可诱导凝胶。三、 实验材料：1.菌株：枯草芽孢杆菌。2.发酵培养基：葡萄糖：4%；蛋白胨：1%；磷酸二氢钾：0.5%；七水硫酸镁：0.2%酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。3.固定化用培养基：淀粉：2；葡萄糖：0.5%；蛋白胨：1%；磷酸二氢钾：0.5%；七水硫酸镁：0.2%；酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。四、实验步骤：（1）培养基灭菌：取250mL三角瓶，分别放入配好的液体培养基100ml，灭菌冷却。（2）种子活化和接种：将枯草芽孢杆菌接入培养基，30培养活化，取活化后的枯草芽孢杆菌分别接入已灭菌冷却的三角瓶培养瓶，振荡混匀。（3）培养：将已接种的三角瓶培养液置于振荡培养箱，200r/min，25培养三天，离心收获菌体并用无菌水洗涤一次，制备菌悬液，使其中枯草芽孢杆菌菌数为2.3107个/ml。（4）海藻酸钠及交联剂的制备：海藻酸钠溶液的制备：取海藻酸钠1.5g，2.0g，2.5g，3.0g，3.5g，分别置于250ml三角瓶中，各加入100ml蒸馏水，放置并搅拌，灭菌。交联剂的制备：配制2%浓度的CaCl2，灭菌。（5）固定化枯草芽孢杆菌的制备将枯草芽孢杆菌细胞菌悬液与海藻酸钠溶液按照11 充分混匀后,用一注射器,将混合液滴入交联剂中, 交联剂的阳离子从外部扩散进入海藻酸钠枯草芽孢杆菌混合液珠内, 将细胞包埋其中。制成凝胶小球，使酵母固定化，用无菌水洗涤固定化细胞，然后加入2% CaCl2，平衡24 h即可使用。（6）固定化细胞的增殖：将固定化细胞转入固定化增殖培养基25，pH6下培养。5 实验结果 利用DNS法检测培养液中葡萄糖浓度，以确定是否产生了淀粉酶，经过一段时间培养，滴入碘液，看是否有蓝色产生。六、思考题1、固定化细胞有何优点和缺点？2、对细胞或者酶进行固定的方法还有哪些？实验五 发酵罐中补料分批发酵研究(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一实验目的加深对培养方法的认识，了解补料分批续培养过程控制方法。二实验原理补料分批培养，是一种介于分批培养和连续培养之间的过渡培养方式，是在分批培养的过程中，间隙或连续地补加新鲜培养基的培养方法。流加培养同时兼有间歇培养和连续培养的某些特点，其优点是，可使发酵系统中维持很低的底物浓度，减少底物的抑制或其分解代谢物的阻遏作用，不会出现当某种培养基成分的浓度高时影响菌体得率和代谢产物生成速率的现象。三菌种与培养基 1.啤酒酵母 2培养基(g/L) 葡萄糖20，酵母浸粉 5.0，KH2PO4 3.0，Na2HP04 1.0，MgSO4 1.0，pH 5.0。流加的浓葡萄糖液质量浓度为25 g100 ml。保持培养基中糖的质量浓度在0.5 g/L，流加液的糖的质量浓度为2530 g/100 m1。四实验方法 1流加培养前的准备工作 在培养罐中加入去离子水，将温度传感器、除菌过滤器安装好，用硅橡胶管连接好取样口、流加液入口，不需要的接口全部封好。橡胶管用弹簧夹夹住，排气口用一小段棉花塞好。确认所有连接没有问题后，打开通风排气系统，检查是否有漏气、阻塞现象(轻轻堵住排气口，看其他地方是否漏气)，确认正常。 2.种子培养 自斜面菌种挑起一环啤酒酵母菌体。接入装有50ml 培养基的250 ml三角瓶中，摇匀后，置于24培养箱培养36 h。将上述培养好的液体种子接入用250ml三角瓶装的灭过菌的100ml液体培养基中，接种量10，在24下培养36h。 3流加培养 培养罐中加入已调配好的培养基后，放在灭菌锅中灭菌121，2030 min，葡葡糖和消泡剂分别同时灭菌。培养罐取出后，开通冷却水进行冷却，同时开动搅拌器，通入无菌压缩空气以防产生负压,冷却到发酵温度25 。利用硅皮管将25 g/100m1葡萄糖液贮瓶和0.1 mol/L氨液贮瓶分别连接蠕动泵和培养罐上的入口，再将两个贮瓶上的排气口塞上棉花用弹簧夹夹住。消泡剂贮瓶排气口塞上锦花。如果传感器不能用蒸汽加压灭菌，可以在室温下把传感锡在75酒精中浸泡加进行灭菌，然后用无菌水洗净，尽快安装在培养罐上。通气量在35 L/min，搅拌转数在200600rpm接种量10。开动蠕动泵流加25g/100mL葡萄糖，使发酵罐内葡萄糖浓度达到2030g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控制培养掖pH为5.0。通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在10左右。流加培养710h，每隔0.5-1h取样测定培养液中葡萄糖浓度、菌体量和副产物乙醇浓度。取样口经常用75的酒精浸泡以保持清洁。培养结束后，将培养液进行蒸汽加压灭菌弃去。清洗培养罐。在发酵过程中消泡剂应尽量少加。 四分析方法 1菌体量(X) 生物量的测定 生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。本实验采用比浊法。以空白培养基为对照，在550 nm处测定发酵液的吸光值。 五实验结果 （1）画出培养液中酵母菌体量(g/L)随流加培养时间的变化曲线。（2）计算酵母细胞的产率(质量分数，葡萄糖)。六思考题1、试分析补料分批发酵在工业上应用情况？2、在发酵过程中可采用哪些措施以增加酵母细胞的生长？附录2生物量测定一、原理细胞的生长表现为细胞数量增加和体积的增大，在一定条件下，单细胞生物细胞质量的多少和细胞的数量存在一定的对应关系，据此测定生长过程中菌体含量的变化可以近似表示细胞数量的变化。二、实验步骤：先称取干燥的空离心管重量，记为W1，取5 mL发酵液于离心管，5000 r/min离心5 min，上清液保存于冰箱进行糖浓度测定，菌体和离心管一起于85烘至恒重后称离心管和菌体重量，记为W2，根据下式计算不同时间的菌体生物量，单位 g/L。实验六 机械搅拌罐培养酵母的动力学模型建立(指导教师:汪文俊 熊海容 王海英 肖新才 实验员: 张继泰)一、实验目的和内容目的：学习和掌握发酵过程的参数检测；掌握发酵罐的操作；掌握发酵过程动力学模型的建立方法内容：类胡萝卜素发酵过程生物量、产物和底物消耗数据测定；建立相关生长、底物消耗和产物生成的动力学模型二、实验原理：通过发酵过程测得的实验数据，依据一定的通用、经典参考模型，建立适合某一特定微生物发酵过程的动力学模型。三、实验步骤：(一)、获得实验数据1. 菌种：粘红酵母4保藏于PDA斜面。2. 培养基1.1 PDA培养基：称取新鲜土豆200 g，切丝放进烧杯，加入约500 ml自来水，于电炉上加热至沸腾，煮沸30 min后用两层纱布过滤，收集滤液加入2030 g葡萄糖，加水至1 L，pH值自然。(斜面制备时加入1620 g琼脂条)1.2 种子培养基(g/L)：葡萄糖30、酵母浸粉5、KH2PO4 2、Na2HPO4 1、MgSO4 2，自来水配制，pH 5.0。1.3 发酵培养基(g/L)：葡萄糖50、酵母浸粉5、(NH4)2SO4 6、KH2PO4 6、Na2HPO4 1、MgSO4 5, pH值自然。3.培养方法3.1菌种活化将一满环斜面保存粘红酵母菌接种于新鲜PDA斜面，2528培养24h。3.2种子制备接种二环活化的斜面菌种于装有100 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，22、200 r/min下培养48 h作为种子液。3.3发酵罐发酵按1.2.3制备发酵培养基，每个5 L发酵罐装入培养基2.5 L (即工作体积2.5L)，装好发酵罐送于卧式灭菌锅0.1 MPa灭菌1520 min，取出发酵罐待冷却至26后将上述种子培养基200 mL在火焰保护下接种到发酵罐中，在通气量为0.1vvm、22下进行培养，每隔8 h取样一次进行酵母生物量、葡萄糖残留量和类胡萝卜素生成量的分析，培养80 h实验结束。1.3.3取样与分析方法见附录1至3(二)、动力学模型选择按照经典的发酵动力学模型，对于牛顿性流体发酵的本实验，在满足这些模型的假设条件下选择如下动力学模型的速率函数作为本实验的参考模型 （1） （2） （3） （4）(三)、生长、底物消耗和产物合成动力学模型建立采用Metlab 7.01软件对数据进行处理，求取上述模型中的max、Ks，将模型简化，代入上述模型中，将上述各式积分，联合求解即可求得发酵过程中生物量、类胡萝卜素产量和底物消耗与发酵时间的函数关系X=M(t)、Q=N(t)和S=L(t)，模型建立完成。测定方法1、 生物量测定参见实验三附录2。2、 残糖测定参见附录1。附录3 类胡萝卜素含量测定取5 mL发酵液6000 r/min离心8 min，蒸馏水洗涤、离心三次，加入二甲亚砜(DMSO) 3 mL，用玻棒将菌体搅拌至菌体溶解于DMSO中，6000 r/min离心8 min，收集上清液于试管中，离心管中再次加入二甲亚砜(DMSO) 3 mL，用玻棒将菌体搅拌至菌体溶解于DMSO中，6000 r/min离心8 min，合并提取液，如此多次直至菌体无色。分光光度计于480 nm处比色，测定总类胡萝卜素含量。总类胡萝卜素计算公式：类胡萝卜素含量(mg/L)1250VfOD480 式中： Vf - 提取液体积； OD480类胡萝卜素480 nm处吸光值。实验七 (趣味实验) 用纯根霉、酵母制作甜米酒甜米酒亦即醪槽儿，它是用米饭和甜酒曲混合，保温一定时间制成的。其中起主要作用的是甜酒曲中的根霉和酵母两种微生物。根霉是藻菌纲、毛霉目、毛霉科的一属，它能产生糖化酶，将淀粉水解为葡萄糖。根霉在糖化过程中还能产生少量的有机酸（如乳酸）。甜酒曲中少量的酵母菌，则利用根霉糖化淀粉所产生的糖酵解为酒精。所以，甜米酒既甜又微酸还醇香，口感舒适、营养丰富，深受人们喜爱。人们通常采用市售酒曲制作甜米酒。由于市售酒曲质量不够稳定，以致使甜米酒的风味变化较大，有时甚至制作失效，造成浪费。鉴于这种情况，我们在指寻学生进行课外活动时，根据甜米酒的制作原理，采用纯根霉、酵母发酵米饭，从而获得风味纯正、稳定的甜米酒。通过该