临床微微生物标本的采集注意事项接种及涂片染色课件ppt课件

微生物标本的采集 接种及涂片染色 湖南省第二人民医院检验科黄露萍 一 标本采集和运送 标本采集和运送是细菌培养成功的最最重要的环节但由于标本的采集和运送常有护士或医生或病人自己完成 所以也是最不容易做好的事情 而且不知道问题所在之处 造成的后果是 阳性率低 标本污染 临床最不能接受的问题 一 痰标本的采集 1 标本采集时间 用抗生素前2 标本采集方法 2 1吸痰 通过气管切口直接将痰吸出 只适用于气管切开患者 2 2双套管毛刷防污染吸痰 PSB 这是最好 最科学的取样方法 但缺点是有创伤性检查 病人不易接受 2 3肺泡灌洗液 对肺心病 呼衰病人有一定的危险 2 4咳痰 是最简单的方法 但污染严重 影响结果判断 二 泌尿标本的采集 1 采集后的标本应立即送检 2 采集时间 多数药物从尿道排泄 所以不管用哪种方法都应在用药前采集 应采集早晨第一次的尿 3 标本管不应含防腐剂和消毒剂 4 采集中段尿时要先用肥皂清洗女性的外阴和男性的外生殖器包括包皮内 然后用清水冲洗 5 长期留置导尿管的患者应在更换新管时留取尿标本 三 分泌物的采集 1 对开放性病灶的采集 如眼结膜脓性分泌物 扁桃体 外耳道 手术后切口 导管治疗感染 瘘管内脓液 生殖道分泌物等均属于开放性病灶 应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌 去除旧的分泌物 用灭菌拭子采集病灶深部的分泌物 也可取感染部位下的组织送检 6 三 分泌物的采集 2 闭锁性脓肿 如淋巴脓肿 肺脓肿 肝脓肿 腹腔脓肿 盆腔脓肿等 对封闭的脓肿常采用穿刺或引流的的方法采样 应在用药前采集 应注意脓液的气味 性状 颜色注意厌氧菌存在的可能 不能及时送检应运用输送培养基 四 便标本的采集 1 采集时间 腹泻患者应在用药前 急性期采集 沙门菌感染 肠热症应在2周内采 厌氧菌出现症状即采集 2 采集方法 自然排便者可用小木棒挑取有脓血和黏液的部位的粪便2 3克 如液状粪便取絮状物盛于无菌的 密封的 不吸水的 容器内或直接盛于增菌液或保存液中 对不易获得粪便患者及幼儿 可用直肠拭子采集后置保存液或输送培养基中送检 五 血液及骨髓标本的采集 4 采血间隔 如第一次采集2套 4瓶 血培养标本 在以后的2 5天不必采血 但除外心内膜炎和导管相关性败血症 5 儿童 采血量是总血量的1 6 延迟培养瓶处理 延迟培养瓶不要放冰箱或孵箱 放常温 尽早送往临床细菌室 7 皮肤消毒液推荐 建议先用70 80 异丙醇去脂 再用葡萄糖酸氯乙定消毒 关于夜班血培养的送检 培养瓶夜班未能及时送到检验科 存在室温即可 不能冷藏也不能放入35 的温箱 过夜不会对检测造成影响 但仍需尽快送检 冷藏可能导致对温度敏感的耐瑟氏菌等死亡 温箱会导致细菌进入生长对数期 从而错过检测的最佳时期 血标本采集间隔时间 对于非持续性菌血症 同时或短时间内采集2 3套血培养 因为体内巨噬细胞吞噬系统会在15 30min内清除掉进入人体内的细菌 可疑急性心内膜炎患者要立即取血作血培养 30分钟内完成3套血培养的采集 采集后立即进行抗菌药的经验治疗 如果24小时内报告阴性 则继续采集2套血培养 13 血标本采集间隔时间 可疑的亚急性心内膜炎患者每间隔30分钟至1h采集1套 连续采集3套标本 如果24小时内报告阴性 则继续采集2套血培养 抽血量和体重的关系 脑脊液标本的采集 无菌操作 由医生腰椎穿刺采样最少1mL 最好 5mL打入3个小管中 以第一根小管送检培养即时送检 一般不能超过1小时 绝对不能冷藏 二 样本拒收标准 1 样本上无病患标签或病患标签与检验申请单不符合 2 样本以不适当的温度 运送培养基及容器送 3 样本的量不足 已被防腐剂固定和运送时间过长 4 样本外漏 容器破损及明显受污染的样本 5 样本的检验项目申请不适合进行 二 样本拒收标准 6 当日重复送样本 除血液培养外 7 痰标本涂片 白细胞25 8 尿液标本培养 标本量太少 少于10ml 9 粪标本培养 放置时间过长 已干 三 分离培养基本操作规范 合格的标本是保证培养成功的重要条件 但如果没有适宜的分离培养基 培养环境以及正确的处理方法同样不能获得好的结果 为此制定如下基本操作规范以保证致病细菌分离成功 19 一 平板的划线分离方法 1 分区划线分离法 图示 2 连续划线分离法 3 Maki滚动法 错误涂法 二 正确的培养基放置方法 1 加盖 倒置 底朝上 3 放置于合适的培养环境2 不可叠加太高 不超过4个 25 三 各种标本的培养基及培养条件 1 痰标本 培养基 5 羊血琼脂 5 兔血巧克力琼脂 中国兰琼脂 培养环境 5 羊血琼脂 5 兔血巧克力琼脂 置5 7 CO2 35 环境培养 其他培养基置35 空气培养 真菌培养 沙保弱琼脂培养基 28 空气培养 2 尿标本 培养基 5 羊血琼脂 中国兰 菌落计数 每个标本都要做 用加样器或定量接种环取样本10ul分别接种于上述培养基均匀涂布整个平皿 次日作菌落计数 培养环境 35 空气环境培养 3 大便标本 培养基 中国兰 SS琼脂 培养环境 35 空气环境培养 疑似伪膜性肠炎 5 羊血琼脂 沙保弱琼脂 5 羊血琼脂置35 空气环境培养 沙保弱琼脂置28 空气环境培养 其他特殊肠道致病菌培养按国家CDC要求执行 4 分泌物标本 培养基 5 羊血琼脂 中国兰 培养环境 35 空气环境培养 5 静脉导管尖端标本 静脉导管尖端 培养静脉导管尖端是为了明确细菌来源 最常用的方法是半定量的方法 方法是用5cm长的导管末端部分在血液琼脂平板上滚动4次 培养物出现15个以上的菌落 提示有潜在的导管相关性感染 导管尖端阳性培养结果 6 脑脊液标本 培养基 5 羊血琼脂 5 兔血巧克力琼脂 葡萄糖肉汤 培养环境 置5 CO2 35 环境培养 7 胆汁或胸水或腹水标本 培养基 如标本量大时可按血液培养方法直接取16 20ml分别种入需氧和厌氧培养瓶 如标本量有限 可接种5 羊血琼脂 中国兰 葡萄糖肉汤 培养环境 35 空气环境培养 8 脓液标本 培养基 5 羊血琼脂 中国兰 培养环境 35 空气环境培养 9 生殖道标本 普通细菌培养标本接种 培养基 5 羊血琼脂 培养环境 35 空气环境培养 淋球菌标本的接种 培养基 接种于专用MTM平皿上 培养环境 置5 CO2 35 环境培养 四 细菌涂片操作规范 涂片 干燥 固定 染色 水洗 吸干 镜检 1 染色一般程序 制备涂片标本 染色 38 2 固定的目的和方法 使细菌的细胞凝固 使菌体与玻片粘得更牢固可改变菌体对染料的通透性加热固定可杀死细菌 比较安全固定的方法将制成的标本匀速通过火焰三次 3 染色 应具备最基本的染色技术 即革兰氏染色 抗酸染色和墨汁染色 革兰染色 革兰染色报告必须包括染色反应或微生物种类和类别 描述物种的形态或结构 如革兰染色见到革兰阳性球菌 呈葡萄状排列 又如革兰染色见到真菌小分生孢子及菌丝 40 革兰染色原理 细菌的等电点较低 约在pH2 5之间 故在中性 碱性或弱碱性溶液中 菌体蛋白质电离后带负电荷 易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合 使细菌被染成紫色或红色 龙胆紫液染10s 染料着染 水洗 碘溶液染10s 媒染剂媒染 水洗 丙酮酒精脱色10 20s 脱色剂 水洗 稀释的石炭酸复红10s 复染 水洗 干燥 镜检 革兰氏染色步骤 42 革兰氏染色注意事项 革兰氏染色成败的关键是酒精脱色 如脱色过度 革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌 如脱色时间过短 革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌 菌龄也有影响 若菌龄太老 由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应 不要涂片太厚 会造成假阴性或假阳性 43 红色革兰阴性菌 紫色革兰阳性菌 链状的革兰阳性球菌 提示链球菌短链 6个细胞 提示肠球菌或B群链球菌 肺炎链球菌 血培养中长链的革兰阳性球菌 6个细胞 提示化脓链球菌或草绿色链球菌 革兰氏阳性球菌 呈堆或四联排列的革兰阳性球菌提示葡萄球菌 革兰氏阳性球菌 革兰氏阴性球菌 外型奇特的酵母菌 不要遗忘革兰阴性杆菌 痰镜检的判断标准 痰培养标本实验室在接种前必须作痰涂片革兰染色 当在低倍镜下白细胞 10个 L 上皮细胞 25个 L时应作为不宜做培养的标本 当白细胞 10个 L 上皮细胞 25个 L时再参照油镜观察标本中细菌分布作出判断 49 痰镜检的判断标准 当标本中细菌种类超过3种以上 未见到钎毛拄状上皮细胞 作为不合格标本 如见到数量不等的白血胞或钎毛拄状上皮细胞或两者同在 含1 2种不同细菌 可考虑继续培养 结果可根据病情再作分析 当涂片中见到1 3种细菌 少量的扁平上皮细胞 少量或较多钎毛拄状上皮细胞均可按合格标本继续培养 痰镜检的判断标准 1 脓细胞 鳞状上皮细胞 细菌种类 细菌种类 4种 视为不合格标本 应予以退回 重新送检 用革兰氏染色来评估呼吸道标本是否合格 10鳞状上皮细胞 LPF 拒收 弹性纤维 中性粒细胞多 鳞状上皮细胞少 有代表性的好标本 纤毛拄状上皮细胞 细胞内细菌 抗酸染色 抗酸染色报告应显示找到或未找到或可疑抗酸杆菌三种结果 报告中应以加号体现标本中抗酸杆菌的存在量 如找到抗酸杆菌 见到染色不典型抗酸杆菌 建议再送标本 不能报告找到结核杆菌但可报告未找到结核杆菌 抗酸染色染色步骤 初染 用玻片夹夹持涂片标本 滴加石炭酸复红2 3滴 在火焰高处徐徐加热 切勿沸腾 出现蒸汽即暂时离开 若染液蒸发减少 应再加染液 以免干涸 加热3 5分钟 待标本冷却后用水冲洗 也可不加热染色5分钟或更久 用水冲洗 脱色 3 盐酸酒精脱色1 2分钟 用水冲洗 复染 用亚甲基蓝溶液复染30s 1分钟 用水冲洗后用吸水纸吸干 抗酸染色注意事项 无菌操作 涂片厚度要适中 染色时间要充分 脱色是关键步骤 要彻底 初染加热勿沸腾勿干涸 57 形态 细长 略弯曲的杆菌 常堆积成团 排列无序 偶可见呈分枝状生长 无鞭毛和芽胞 染色性 不易着色 抗酸染色阳性 菌体呈红色 背景及非抗酸性细菌呈兰色 结核分枝杆菌 58 结核分枝杆菌 59 结核分枝杆菌 60 结核分枝杆菌 61 涂片结果报告标准 62 墨汁染色 墨汁染色报告应显示阳性和阴性结果 不能报告找到新型隐球菌但可报告未找新型隐球菌 63 新型隐球菌形态 酵母菌 芽生繁殖在脑脊液 痰液组织中呈圆形或板圆形 直径约5 20 m 四周包括肥厚的胶质样夹膜 墨汁染色染色步骤 取脑脊液第一管标本3000r离心15分钟 移去上清液 试管内留下0 5ml左右 混匀 分别取2滴混匀了的脑脊液和墨汁放入清洁小试管底部 混匀 取一张清洁载玻片 把1滴脑脊液和墨汁的混合物放在载玻片 把盖玻片轻轻入在混合物上 避免产生气泡 65 墨汁染色注意事项 在用低倍镜搜索时一定要适当调整显微镜的可变光栏 不要报显微镜可