蛋白芯片：蛋白表达和抗体筛选的有力工具.doc

蛋白芯片：蛋白表达和抗体筛选的有力工具Angelika Lueking, Martin Horn, Holger Eickhoff, Konrad Bussow, Hans Lehrach, and Gerald Walter中华基因网译摘要：基因组序列的信息是由蛋白表达才行使其功能的，进而使生命能够正常进行。我们研究和发展了一个在cDNA微矩阵上进行基因表达谱研究的一种辅助的方法，这种技术能够在芯片大小的蛋白微矩阵上进行大量的基因表达和抗体筛选。这种技术应用一种带有一种新的转移图章的机械手进行点样，蛋白溶液被高密度的点在聚偏二乙烯二氟（PVDF）膜上。在此膜上能够高灵敏度的检测出经纯化的特殊蛋白。在该试验中，用92个人cDNA克隆在酶标板上表达所得细菌溶胞物作为蛋白质点成芯片，在此芯片上能够可靠地进行纯化的蛋白表达物的检测。假阳性克隆和以不正确阅读框架来表达蛋白的比率低。所挑选克隆产物的特异性在相同的芯片上应用单克隆得到证实。带有一些不相关蛋白的一些抗体的交叉反应表明，用来检测抗体特异性的蛋白质芯片可以对蛋白的整个库进行检测。因为这种应用不仅仅局限在抗原-抗体体系，蛋白质芯片也能够为基因表达和受体-配体相互作用的大量检测提供一个普遍的方法。 关键词:微距阵;机械人技术;蛋白质;基因;表达；抗体；筛选 尽管整个人类基因的40-80%现在已经以表达序列标签（EST）的形式在dbEST数据库（/dbEST）中存在，只有一小部分基因确定了其功能。而整个基因组表达的检测被认为是功能研究的必要前提。自动技术使应用综合表达方式的分析测定大量基因活动成为可能，从而得到致病的与正常的或发展中的不同组织的比较指纹。从高密度的过滤膜开始，DNA微矩阵现在已经被开发成芯片的形式。应用微矩阵，已经得到了Arabidopsis thaliana 、 Saccharomyces cerevisiae和人类淋巴细胞和组织如骨髓、脑、前列腺和心脏的基因表达谱。CDNA微矩阵已经被应用于检测复杂疾病如类风湿性关节炎、黑素瘤、尤因瘤等。从逻辑上讲,下一步应获得差异表达的cDNA克隆编码的蛋白产物谱。这就要求有一个高度平行方法来进行蛋白表达分析,包括大量的cDNA克隆在合适的载体系统上同时表达和蛋白产物高速点阵。 我们在前面已经指出cDNA文库能够在高密度的过滤膜上进行的检测（21）。应用机械人技术，把人类胎儿脑cDNA表达文库（hEx1）点阵在酶标板上，然后把细菌群体定格在PVDF过滤膜上，诱导融合蛋白的原位表达和应用抗体来检测一个含有His6标签的原位。我们现在已经把这种方法进一步发展，应用一个装有一个平台的点样机械手的新的印章来自动点阵细菌融合物形成蛋白芯片。这些蛋白芯片能够进行高灵敏的蛋白表达和抗体特异性筛选，而且能够为大量的受体配体相互作用的研究提供一个强有力的工具。 材料与方法 载体构建 pQE-30NS载体在以前的文章中已有描述（其在GenBank中的序列标识号为AF074276）。载体pQEBE6应用PCR反应在pQE-30NS载体的MRGS和His6中插入编码LNDIFEAQKIEW的寡聚核苷酸肽，这样就使RGSHis6变成两部分。 抗体 混合液中的单抗及厂家如下：Qiagen生产的鼠抗RGS-His，1:2000稀释；诊断研究公司生产的克隆6C5，鼠抗兔GAPDH，1：5000稀释；Transduction实验室生产的克隆68鼠抗HSP90，1：2000稀释，Serotec 有限公司生产的鼠抗微管蛋白。 二抗是F（ab）兔抗鼠IgHRP（sigma） 和F（ab）鼠抗兔IgHRP（Serotec Ltd.）,1:5000稀释，分别用来检测大鼠和小鼠的单克隆。 大规模蛋白表达和纯化 蛋白质在大肠杆菌SCS1株系的液体培养基中表达。用含有100g/mlAP和15g/ml 卡那900升SB培养基转接10ml大肠杆菌SCS1株系，37摇菌，过夜培养，直到OD600达到0.8，加入IPTG含量到1mM。在37培养3.5小时，然后在4冰上冷却。用在2100克离心10分钟进行细胞收集。用100ml磷酸缓冲液重悬，然后离心。细胞在溶解缓冲液中溶解，置冰上30分钟，每克湿重细胞加缓冲液3ml，缓冲液中含有0.25mg/ml溶解酵素。DNA在冰上应用50%的功率超声波均液进行打碎三次，每次1分钟。混合物用10000g离心30分钟澄清。然后加入NTA琼脂糖，在4下摇晃1小时混合。混合液到入一个柱子中，然后用10倍体积的含有20mM咪唑的缓冲液冲洗，之后用含有250mM咪唑的缓冲液洗涤蛋白，再用在TBS溶液过夜透析。 大量的小规模的蛋白表达 从人类胎儿脑的矩阵cDNA表达文库hEx1中挑选的克隆进行蛋白表达。这个文库直接克隆在Pqe-30NST载体中，用IPTG诱导His6标签融合蛋白表达。用100l/mlSB培养基加入96孔酶标板的2ml体腔中，培养基中含有100g/ml的AP和15l/ml的卡那。把来自保存在384孔文库板中大肠杆菌的SCSI细胞进行接种培养，用带有96个钢针（长6cm）的复制装置进行接种。经过在37下过夜摇晃培养，加入900l预热的培养基，继续培养1小时。IPTG加入到终溶液中到1mM。下面所有的步骤，包括离心均在96孔板中进行。在1900克离心10分钟进行细胞收集。用磷酸缓冲液重悬冲洗，再离心5分钟，用150l缓冲液A进行溶解。在4000g离心5分钟形成小片，去除细胞碎片。悬浮液用带有不吸附蛋白的0.65m的PVDF膜的96孔过滤板进行过滤。 自动过滤膜点样 把预先切成25X75mm的滤纸膜浸泡在96%的乙醇中，用蒸馏水漂洗1分钟，用带子把5个湿的滤膜固定在230X230mm塑料盘中。应用自动转移图章进行点样，以完全相同的方式在x-y-z方向上进行间隔为5m的固定点样。这样点样的密度大约为300个样品/cm2。转移图章带有间隔为4.5mm的4X4共16个针进行点样。由于此间隔能够和384孔板上的间隔大小一致，这个工具使在384孔板上进行高密度的点样成为可能。不锈钢针的钝头尖端的大小为250m。在点样前，点样小机件在30%的乙醇槽中冲洗，然后用风扇吹干，防止交叉污染。在这个实验中，每个针以4X4的图案点样。每一种图案包括4墨标定点，这4个墨标定点由6个重复的样品点包围（一共12个样品点）。每个点用同样的蛋白样品（每个5nl）点5次。预先调节点样的高度，点96个样品大约要20分钟，产生5个完全一样的蛋白芯片。 点样后，膜在乙醇中浸泡1分钟，用蒸馏水漂洗，用TBST冲洗1分钟，用2%的BSA/TBST阻断60分钟，然后在2%的BSA/TBST中在室温与单抗保温1小时。然后，膜在TBST中清洗10分钟，两次，在2%BSA/TBST中和二抗保温1小时。然后，膜在20mlTBST过夜清洗，然后在2mlCN/DAB溶液中保温1-10分钟，正对照应用阻断斑来检测。用冷却过的CCD照相机进行拍照。图片用AIDA软件包分析，得到点的识别和定量。结果点的值转化成Excel电子数据表。 结果与讨论 蛋白芯片的制备 在液体培养基中培养细菌进行蛋白表达，表达后的混合物点在PVDF膜上，表达后的混合物即用原始的溶胞物，也用了经过IMAC膜处理纯化的产物。应用PVDF膜是因为这种膜上支持蛋白的结合能力、机械强度（与硝化纤维相比）以及前面令人满意的性能（21）。新的点样图章（图1）由尖端为250m大小的一组针组成，几乎是原来用于生产原位蛋白表达过滤膜450m针大小的一半。和我们第一次检测结果一样，图2，3，4表明，和在原位膜上相同点样密度，针的直径越小点样密度更大。在一个222X222mm的原位膜上能包括27648个克隆（一个引导点的5x5复制点方式），而用新的转移图章在相同的面积上就能超过10万样品。这就使整个芯片的大小减小许多，更便于在显微镜载玻片的形式应用（25x75mm4800个样品，相当于2400复制品）。更小的装置由于应用更小的体积覆盖于膜上的缓冲液更小，因此比较经济和高密度和原位膜相比较。在芯片上得到的信号更灵敏和定位更准。对于下一步蛋白芯片的膜，我们会进一步努力提高其密度。应用高速的喷墨点样仪于活化的玻璃表面。制作蛋白质芯片的其他方法也有报道，即应用单层硅的影印石板术或喷墨法于聚苯乙烯膜上，和我们点样技术相比，这些方法着中于以单一蛋白的形式微量免疫分析的纤维膜的研究. 特殊蛋白检测的灵敏性 芯片上特殊蛋白检测的灵敏性是用三种不同浓度的纯化的特殊蛋白的来检测的。三种蛋白即：人类甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶（GAPDH，Swiss-Prot P04406）,一个人类热休克蛋白90C末端片段(43.3kDa)（HSP90，Swiss-Prot P07900）和鼠免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP, Swiss-Prot P06767)。随后，芯片在一个单抗抗-GAPDH 的抗体，兔抗鼠IgG HRP 和HRP培养基CN/DAB中培养（图2A）。检测的灵敏性，如能够被清楚地检测的最低浓度，背景上的特殊点（检测极限）被计算成10fmol/u，相当于10nl被检测的点中含有 250amol或10pg的 GAPDH。 蛋白表达的大量检测 已排成阵列的人类胎儿脑cDNA文库hEx1(21)的92个克隆未经加工的胞溶物，这些原始胞溶物以前已经在原位过滤膜上应用单克隆抗体RGS-HIS进行了蛋白表达的鉴定，这次实验中这些原始胞溶物与4个对照样品及定位墨点一起以双倍的方式点样。应用相同的抗体对芯片进行RGS-His6 标记融合蛋白表达的检测（图.2A）。两个重复对照的相对密度相互对比，作为结果的对角线表明这种检测方法的重复性较好。因此，所有96个样品重复的平均值和阳性检测的随机特异性极限为7500相对强度。在这些条件下，负对照（H1，无插入子的PQE-30NST载体）其检测结果阴性很清楚的（相对强度为1500），正如HSP90克隆，此克隆带有被分开的RGS-His6表位（H2，载体PQE-BE6；相对强度为0）。一个具有RGS-His6 标签GAPDH克隆的溶解物（H3，PQE-30NST）用来作为正对照并出现一个21000相对强度的信号。应用一个鼠BIP克隆得到一个清楚的正对照是令人吃惊的，因为这一克隆也带有一个被分开的RGS-His6表位。这一反应可能是由于RGS-His6表位部分再建而造成的，其再建是由于BIP的构象特性。 92个公认hEx1表达克隆中54个cDNA插入子与人类基因的GENBANK目录中的一致。这些插入子由于他们的阅读框架被检测，与载体编码的RGS-His6标签序列相关。34个插入子（63%）被证明已经以正确的阅读框架（RF+）被克隆，而20个（37%）是以不正确的阅读框架（RF+）被克隆的；因此，这些克隆不可能进行以期望的蛋白表达。然而，所有的92个克隆最初被选为在原位杂交膜上蛋白表达子是由于单克隆抗体RGS-His具有清楚地阳性信号（强度为2级水平和3级水平）。在微矩阵上，以不正确的阅读框架（RF-）被克隆蛋白表达子被检测的数目降低为70%，而只有6 RF（-）克隆仍显示阳性。这些表明新的芯片技术比原位过滤膜一个主要的先进的特点是它能够排除不正确的阅读框架克隆。另一方面，只有一个RF（+）克隆在特异性极限下是清楚的，而在这种筛选中被消除，可能是由于在这个酶标板上被表达的蛋白量不够。这又强调了我们方法的实质是根据正测序和/或蛋白特性的证实。 总之，我们在微矩阵上进行大量的蛋白表达检测的假阳性比率低于2%（总共54个克隆中1个未检测RF（+）克隆。假阳性克隆的比率，以不正确阅读框架表达的蛋白，降低到11%，而原位过滤膜的比率为37%。这样使蛋白芯片作为蛋白表达检测的灵敏的、较为经济的工具。 抗体特异性筛选 92个hEx1表达克隆和4个对照点在同一个芯片上，应用单克隆抗体筛选为人类蛋白GAPDH，HSP90和微管蛋白。而抗GAPDH抗体单独的检测出的其目的抗原（H3，图4A），抗-HSP90有优先的识别出其目的抗原（H2，图4B），但是至少有两个克隆存在交叉反应（H10，60S核糖体蛋白L18A和H3，GAPDH）。抗体间的交叉反应在抗微管蛋白筛选中更加突出（图4C）。而在成批的检测中有两个RF（+）微管蛋白克隆被特异性的识别出和一个RF（-）克隆（C7）没有被检测出，9个其它的克隆表明抗-微管蛋白反应在随机特异性极限之上。这些克隆中的两个克隆（B1和B12）为未知蛋白，G1是RF（-）微管蛋白。H3是图3中的GAPDH正对照，从某种程度上是非特异性的交叉反应（图4B和4C）可能是由于蛋白表达的高表达的原因。令人吃惊的是，在极限上所有的5个克隆以正确的阅读框架表达出核糖体蛋白（E5，RPL3；H10，RPL18A；E6和D8，RPS2；F7，RPS3A）。在此检测的芯片中，只有一个附加的核糖体蛋白没有表现出抗-微管蛋白反应。被抗-微管蛋白识别的原位（YL1/2）被证明为线状序列，螺旋成用酪氨酸酶酶解的羟基端碎片。根据那些作者，序列的最低要求，正如在二酞研究中所定义的，在负极链中倒数第二个位置上跟上一个带有一个游离的羟羧脂集团的芳香性的残渣。因为在我们的芯片上核糖体蛋白无交叉性反应符合这些要求，其它的原位可能模拟抗原性的特异性。 总之，在蛋白芯片上能检测出抗体的交叉反应是很普通的，因为抗体通常不能用来检测整个蛋白文库的。这就表明一个有