PCR的注意事项.ppt

PCR技术注意事项 引物的设计引物在PCR反应的浓度 模板模板的种类模板变性温度 TaqDNA聚合酶使用注意事项 PCR缓冲液使用注意事项 PCR循环次数注意事项 防止污染的方法 引物类的注意事项 寡核苷酸 dNTP 使用注意事项 温度与时间的注意事项 注意事项 一 引物两引物间距离决定扩增片段的长度 两引物的5 端决定扩增产物的两个5 末端位置由于引物是决定PCR扩增片段长度 位置和结果的关键 因此 引物设计也就更为重要 引物的设计 1 长度一般最低不少于16个核苷酸 而最高不超过30个核苷酸 最佳长度为20 24个核苷酸 有时可在5 端添加不与模板互补的序列 如限制性酶切位点或增强因子等 以完成基因克隆和其它特殊需要 但要在酶切位点的5 端加上额外的3 4个核苷酸 以确保附加的酶切位点有效 2 两个引物之间不应发生互补 特别是在引物3 端 即使无法避免 其3 端互补碱基也不应大于2个碱基 否则易生成 引物二聚体 6 引物扩增跨度 以200 500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段 7 引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点 这对酶切分析或分子克隆很有好处 3 G C 含量引物的组成应均匀 尽量避免含有相同的碱基多聚体 两个引物中 G C 含量应尽量相似 4 引物内部应避免内部形成发夹结构 5 引物长度 15 30bp 常用为20bp左右 引物在PCR反应中的浓度1 一般在0 1 1 M之间 2 浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物 3 一般来说用低浓度引物经济 特异 但浓度过低 不足以完成30个循环的扩增反应 则会降低PCR的产率 二 温度与时间的设置 基于PCR原理三步骤而设置变性 退火 延伸三个温度点 在标准反应中采用三温度点法 双链DNA在90 95 变性 再迅速冷却至40 60 引物退火并结合到靶序列上 然后快速升温至70 75 在TawDNA聚合酶的作用下 使引物链沿模板延伸 对于较短靶基因 长度为100 300bp时 可采用二温度点法 除变性温度外 退火与延伸温度可合二为一 一般采用94 变性 65 左右退火与延伸 此温度TawDNA酶仍有较高的催化活性 变性温度与时间 变性温度低 解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般情况下 93 94 min足以使模板DNA变性 若低于93 则需延长时间 但温度不能过高 因为高温环境对酶的活性有影响 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性 就会导致PCR失败 退火 复性 温度与时间 变性后温度快速冷却至40 60 可使引物和模板发生结合 由于模板DNA比引物复杂得多 引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 退火温度与时间 取决于引物的长度 碱基组成及其浓度 还有靶基序列的长度 对于20个核苷酸 G C含量约50 的引物 55 为选择最适退火温度的起点较为理想 寡核苷酸 dNTP 在PCR反体系中 dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性 高浓度dNTPs易产生错误掺入 而浓度太低 可降低反应物的产量 PCR常用的浓度为50 200 M 不能低于10 15 M 四种dNTP的浓度应相同 其中任何一种浓度偏高或偏低 都会诱导聚合酶的错误掺入 降低合成速度 过早终止反应 TaqDNA聚合酶 由于DNA模板的不同和引物不同 以及其它条件的差异 聚合酶的用量亦有差异 酶量过多会导致非特异产物的增加 模板的种类 单 双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品 若起始材料是RNA 须先通过逆转录得到第一条cDNA 用质粒作模板时 线性化的比环状的效果好 但在实际操作中 往往不需要将质粒线性化 而直接用做模板 当使用高分子量的DNA 如基因组DNA 做模板时 如果用适当的酶先进行消化再作为模板 扩增效果会更好 模板 模板 模板核酸的量与纯化程度 是PCR成败与否的关键环节之一 模板变性温度 是决定PCR反应中双链DNA解链的温度 达不到变性温度就不会产生单链DNA模板 PCR也就不会启动 变性温度低则变性不完全 DNA双链会很快复性 因而减少产量 一般取90 95 加入TawDNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95 以保持DNA聚合酶的活力 PCR缓冲液 PCR的标准缓冲液为10 50mM的Tris Hcl缓冲液和1 5mMgCl Mg2 的存在至关重要 影响PCR的特异性和产量 Mg2 过量易生成非特异性扩增产物 Mg2 不足易使产量降低 反应中 各种dNTP浓度为200umol L时 Mg2 浓度为1 5 2 0mmol L为宜 Mg2 浓度过高 反应特异性降低 出现非特异扩增 浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性 使反应产物减少 PCR循环次数 常规PCR循环次数一般为25 40个周期 循环次数过多 非特异性背景严重 复杂度增加 循环反应的次数太少 则产率偏低 所以 在保证产物得率前提下 应尽量减少循环次数 PCR技术中最令人头痛的问题是 易污染 防止污染的方法 1 避免交叉污染 勤换枪头和高压枪头和PCR管 2 引物设计要正确 选择可靠的生物公司合成引物 如果公司不好 给的引物会不出结果 据说上海生工不错 3 DNA提取要成功 4 引物和模板和体系所加的比例要合适 模板过量会抑制体系的反应 5 设立适当的阳性对照和阴性对照 阳性对照用于结果可预知的样品 证明实验体系正常 防止PCR抑制造成的假阴性 阴性对照 不加模板的试剂对照 检查污染 进行反转录PCR 用于未转录的对照来防止基因组DNA的污