植物抗旱基因工程研究进展.doc

综述与专论中图分类号 : Q943 . 2文献标识码 :A文章编号 :1002 - 5464 (2001) 04 - 0021 - 05植物抗旱基因工程研究进展Re se arch Pro gre s s in Plant Dro ught- re si st ant Ge ne- e ngine e ring张秀海1黄丛林1沈元月1 ,2曹鸣庆1ZHANG Xiu - hai1HUANG Cong - lin1yue1 , 2CAO Ming - qing1SHEN Yuan -1北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心 ,北京 100089 ;2 中国农业大学果树分子发育生物学实验室 , 北京 1000941Beijing Agro - Biotechnology Research Center , Beijing 100089 ; 2L ab. of Molecular Develop mental Biology ofFruit Trees , China Agricult ural U niversit y , Beijing 100094 ,China摘 要 : 干旱 、高温 、低温 、盐胁迫等是影响植物生存的主要逆境因子 ,它们均引起植物失水 ,导致细胞生理干旱 。作者对植物抗旱的生物学原理及其基因工程研究进展进行了论述 。关键词 : 植物 ;抗旱 ;生物学原理 ;基因工程Ab stract : Drought is a serious p roblem for plant growt h and develop ment , biological mechanism of plant drought - resis2tance and p rogress in plant drought - resistant gene - engineering were reviewed. Ke y wo rds : plant ; drought- resistance ; biological mechanism ; gene- engineering植物暴露在自然环境中 ,时刻受到环境因子的影响 ,干旱 、高温 、低温 、盐胁迫等非生物逆境严重影 响了植物的生存和产量 。这些逆境因子均造成植物细胞缺水 ,产生干旱信号 ,诱导植物的抗旱反应 。目前 ,水资源短缺是公认的全球性环境问题之 一 。全 球 干 旱 、半 干 旱 地 区 约 占 土 地 总 面 积 的36 % ,占耕地面积的 43 % 。干旱影响了植物的生长发育 ,造成作物严重减产 ,使我们的生存环境日益恶 化 ,同时也加剧了全球性的粮食危机 。因此展开抗 旱育种工作非常必要 。常规的抗旱育种工作具有很大的局限性 ,它只 能在相近的属种之间通过杂交获得抗旱性 ,极大地限制了可以利用的基因资源 ; 在通过杂交引入抗旱 基因的同时 ,不可避免地会引入其他不相宜的基因 , 需要经过多次回交才能得到较为理想的抗旱品种 。 这样增加了抗旱育种工作的难度 ,延长了育种时间 。 通过基因工程手段改进作物的抗旱性则克服了以上缺点 ,和常规育种相比 ,具有周期短 ,可利用基因资源广泛的优点 ,在抗旱育种工作上具有广阔的应用 前景 。抗旱研究工作最早在微生物上展开 。以酵母 、细菌为模式生物 ,研究了生物的抗旱机理 ,克隆了一些抗旱基因 ,并在植物上得以验证1 ,2 ,3 。最近抗旱 工作的研究重点转向了高等植物 ,本文就植物抗旱的生物学原理及其基因工程研究进展加以概述 。植物抗旱的生物学原理11 . 1气孔行为植物对干旱信号的形态学反应是通过调节气孔 开度 ,防止植物体内水分散失 , 维持一定的光合强 度 。气孔的反应方式有两种 : 一种是对空气湿度的 直接反应 ;另一种是对叶片水势变化的反应 。1 . 2渗透调节积累渗透调节物质是植物抗旱的又一重要策 略 。目前已知的渗透调节物有 :甘露醇 、脯氨酸 、甘北京市科委高技术室项目和北京市科委合同项目作者简介 :张秀海 ,1972 年生 ,男 ,博士 ,助研 。主要从事植物抗逆境分子生物学研究 。 通迅作者 :黄丛林 , E - mail :clhuang p ublic . bta . net . cn氨酸甜菜碱 、海藻糖 、果聚糖 、肌醇 、多胺等小分子化合物 。它们在植物受到干旱 、高温 、低温 、盐等非生 物逆境胁迫时 ,在细胞内大量积累 ,进而增强植物的 保水能力 ,稳定体内的渗透压平衡 ,使植物能够忍耐 失水所带来的负面影响 。此外 ,膜的通透性对于植物的水分调节也具有重要意义 。在高等植物中冻害 敏感程度与细胞 膜 中 脂 肪 酸 的 不 饱 和 程 度 密 切 相 关 ,细胞膜中的不饱和脂肪酸可以将细胞膜的相变 温度降至 0 ,提高植物耐失水的能力 。1 . 3 L ea 蛋白保护L ea 是在种子成熟和发育阶段表达的基因 ,这些 基因也在因受到干旱 、低温和盐渍等环境胁迫而脱 水的营养组织中高度表达 ,提高植物的抗旱性 。L ea 蛋白在抗旱中所起的作用 ,可能表现在以下几个方 面 :(1) 影响细胞结构 , 通过与细胞骨架蛋白相结 合改变细胞的完整性和通透性 ; 通过与磷脂双分子 层作用增强细胞膜在失水情况下的稳定性 ;(2) 影响细胞的代谢从而增强或减弱通过糖酵 解或光合作用产生 A TP 的能力 ;(3) 作为一种渗透调节物质调节细胞的渗透压 平衡 。1 . 4 光合作用调节通过改变光合作用途径 , 抵抗干旱的胁迫 。C3 途径是白天开放气孔进行 CO2 的吸收和固定 ,夜晚 关闭气孔 ,不利于在干旱条件下保持水分 。而 CAM 途径是夜间开放气孔进行 CO2 的吸收和固定 ,白天 关闭气孔减少蒸腾失水 。某些植物在水分亏缺的胁 迫下 ,可以由 C3 途径转变为 CAM 途径 。1 . 5调控抗氧化防御系统 植物在遭受干旱胁迫时通常伴随着活性氧中间产物的生成 。这些有毒的分子对细胞膜和一些大分子物质造成破坏 ,尤其是对线粒体和叶绿体的破坏 , 使细胞受到氧化胁迫 。植物在抵御氧化胁迫时会形 成一些能清除活性氧的酶系和抗氧化物质 ,如超氧歧化酶 、过氧化物酶 、过氧化氢酶和抗坏血酸等 。它 们能有效清除活性氧 ,提高植物的抗旱性 。1 . 6 水通道调节干旱胁迫下的水分供应 ,对于细胞维持膨压 ,进 行正常代谢是非常重要的 。植物体内的水通道蛋白可以形成选择性的水运输通道 ,允许水自由出入将离子或其它有机物拒之门外 ,从而提高植物旱性 。植物抗旱基因工程2随着人们对植物抗旱机理了解的日益深入物抗旱基因工程的研究进展也十分迅速 。通过工程手段将生物抗旱相关基因导入植物体内 ,了一些抗旱的转基因植株 ,其抗旱性状表现良好2 . 1 渗透保护物质 ( Osmop rotectant ) 生物合成键酶基因 许多植物在失水胁迫条件下会积累小分子性溶质或渗压剂 。研究报道通过基因工程手段露醇 、脯氨酸 、果聚糖等小分子相溶性溶质或渗 生物合成的关键酶基因导入植物体内 ,使它们 表达可一定程度地提高植物的抗旱性 。2 . 1 . 1 甘露 醇 ( mannitol ) 生 物 合 成 的 相 关 基 mtlD 是从 Esche richi a col i 分离的 1 - 磷酸甘露 氢酶基因 ,是甘露醇合成的关键酶编码基因 。Tarczynski 等4 报道转 mtlD 烟草耐盐性提Tho mas 等5 将 mtlD 导入拟南芥 , 转基因植株子因积累甘露醇在高盐下能萌发 ,而对照植株子则不能萌发 。 Karakas 等6 报道 , 与对照相比mtlD 烟草在盐胁迫下干重略有增加 ,而在干旱下则无差异 ; 甘露醇的积累对渗透调节还有负 作用 。进一步研究发现 ,使 mtlD 在叶绿体中定达 ,转基因烟草叶片叶绿体中甘露醇的浓度可mM , 植株对 met hylviologen ( MV ) 诱导的氧化 的耐性提高 ,保护叶绿素7 。2 . 1 . 2 脯氨酸 ( Proline) 生物合成的相关基因- p yrroline - 5 - carbo xylate synt hetase ( P5CS) M ot hbea n 中分离得到的 ,其编码蛋白催化裂解 酸盐转变为 1 - p yrroline - 5 - carbo xylate ,是 酸合成的关键酶编码基因 。Kavi kisho r 等8 将 P5CS 基因导入烟草 ,转植株脯氨酸含量比对照高 1018 倍 ; 在盐胁迫下 ,与对照相比 ,转基因植株根的长度和干重增植株生物产量提高 ,花发育得更好 ,果荚数目和的种子数也增加 。Zhu 等9 将同一基因转入水使用 ABA 或逆境诱导的特异启动子 ,在逆境胁转基因植株脯氨酸含量是对照的 2 . 5 倍 ,初步究结果表明 ,在盐或水分胁迫下转 P5CS 基因水稻第二代根和茎的鲜重增加 ,生物产量也增加 ; 耐盐力与 积累的脯氨酸水平相关 。2 . 1 . 3甘氨酰甜菜碱 ( Glycine betaine) 生物合成的2 . 1 . 5 果聚糖 ( Fructan) 生物合成相关的基因 果聚糖是果糖的多聚分子 ,由于其高可溶性使植物的 渗透调节能力提高 。SacB 是从细菌中分离出的果聚 糖合酶基因 ,是合成果聚糖的关键酶编码基因 。Pilo n- Smit s 等17 将 sacB 导入烟草 ,在非胁迫条件下果聚糖积累对植株生长和产量无影响 。在 P E G 介导的渗透胁迫下转基因植株的耐受性明显提高 , 耐逆性强弱与果聚糖积累量呈正相关 。2 . 1 . 6肌醇甲酯 ( D - o no nitol) 生物合成相关基因 转肌醇甲基转移酶基因 ( IM T1) 烟草积累肌醇甲酯 ,耐盐性和耐旱性提高18 。由于细胞溶质中肌醇 甲酯的含量高达 600 mM ,它不能进入液泡 ,作为一 种渗压剂对 Na + 起渗透平衡作用 。相关基因与甘 氨 酰 甜 菜 碱 合 成 有 关 的 重 要 基 因有 :1) betA : E. col i 胆碱脱氢酶 ( choline dehydroge2nase) 基因 ;2) co dA : A rt h robacte r gl obi f or m is 胆碱氧 化酶基因 。Lilius 等 10将 betA 导入烟草 ,在 300 mM Na2Cl 胁迫下转基因植株干重增加 ,耐盐性提高 。将 co2dA 导入拟南芥 ,转基因植株积累甘氨酸甜菜碱 , 耐 盐性和耐寒性也提高11 , 12 。Deshnium 等13 将 co2 dA 导入 S y nechococcus sp . PCC7942 中 ,提高了其耐 盐性 。Sakamoto 等14 报道将 co dA 导入水稻 , 其中 一种转基因水稻 ( ChlCOD) 植株 co dA 在叶绿体中定向表达 ,另一种转基因水稻 ( Cyt COD) 植株 co dA 在 胞质溶胶中定向表达 。两种转基因植株耐盐性和耐 寒性均提高 ,转基因植株叶片甘氨酰甜菜碱的含量高达 1 5mol/ g 鲜 重 。与 对 照 相 比 , 用 150 mM NaCl 胁迫处理后转基因植株恢复快 。在高盐和低温胁迫 下 ChlCOD 转 基 因 植 株 对 光 抑 制 的 耐 性 较 Cyt COD 转基因植株的高 。我们认为甘氨酸甜菜碱 可能有稳定蛋白的结构和功能的作用 ,因为甘氨酸 甜菜碱的浓度太低还无法进行渗透调节 。2 . 1 . 4 海藻糖 ( Trehalo se) 生物合成的相关基因海藻糖是非还原的二聚葡萄糖 ,广泛存在于细菌 、真 菌 、昆虫和一些植物中 ,与海藻糖合成有关的重要基 因有 :1) TPS1 :酵母 6 - 磷酸海藻糖合成酶基因 ; 2) ot sA :细菌 6 - 磷酸海藻糖合酶基因 ; 3) ot sB : 细菌 6- 磷酸海藻糖磷酸化酶基因 。将 TPS1 导入烟草 , 转基因植株表现出多种性 状的改变 ,耐旱性提高 15 。Pilo n - Smit s 等人 16将 ot sA 和 ot sB 导入烟草 ,与对照相比 ,转基因植株 在干旱胁迫下叶面积增大 ,植株干重增加 ,海藻糖含 量达 0 . 17 mg / g 鲜重 ,在干燥空气中浇水状况良好的转基因植株幼苗离体叶片保水能力较对照的强 , 转基因植株叶片有更高的光合活性 。认为上述转基 因植株海藻糖含量低 ,还无法形成渗透调节 ,但在细 胞积累的所有可溶性糖中海藻糖含量最高 ,这可能 是因为转 Ot s 基因植株的低渗透势造成的 。2 . 1 . 7多胺 ( Polyamine)多胺是小分子 、广泛存在的氮素类细胞组分 ,植物在干旱 、高盐等逆境条件下会积 累 多 胺 , 耐 盐 性 高 的 栽 培 物 种 多 胺 含 量 也高19力20, 外 施 多 胺 能 提 高 燕 麦 叶 片 的 渗 透 调 节 能。与多胺生物合成有关的重要基因有 : 1) Odc :小鼠鸟氨酸脱羧酶编码基因 ,鸟氨酸脱羧酶催化鸟氨酸向腐二胺转变 ; 2) Adc : 燕麦精氨酸脱羧酶编码 基因 。Minocha 等21 研究表明 ,转 Odc 胡萝卜细胞系过量表达 Odc ,转基因细胞能够耐 040 hr 的盐胁迫 和渗透胁迫 。Capell 等22 报道利用 CaMV 35 S 启动 子在水稻中过量表达 Adc , 在干旱胁迫下抑制了叶绿素的降解 ,提高了抗旱性 ,但也严重影响植株的发 育 。2 . 2胚胎后期发生丰富基因 (L ea) 或 L ea 相关基因 在种子的后期发育过程中 ,大麦类群 3 L EA 蛋白 - HVA1 在糊粉层和胚中特异表达 , 与种子的耐脱水性有关23 。ABA 和几种逆境 ( 脱水 、高盐 、高 温) 能快速诱导 HVA1 在大麦幼苗中表达24 。Zhu等25用水稻 actin 1 启动子将大麦 HVA1 基因导入水稻 ,转基因植株在叶片和根中均积累 HVA1 蛋白 ,其第二的代耐水分亏缺和耐盐能力明显提高 。Stepo nkus 等26 报道转 Co r15a 拟南芥的叶绿体 和原生 质 体 耐 寒 性 提 高 。测 定 活 体 叶 绿 素 荧 光 表 明 ,与对照相比 ,光合系统 I I 所受冻害减轻 。进一步 研究发现 ,CO R15 am 多肽与脂双层作用 ,影响质膜 的冷稳定性 ,从而提高了原生质体的耐冷性 。2 . 3编码转录因子的调节基因通过转化调节基因来提高植物脱水胁迫的耐性 是一条十分诱人的途径 。由于在逆境条件下这些逆 境相关的转录因子能够调节功能基因的表达和信号 转导 ,它们在转基因植物中的过量表达会激活许多抗逆功能基因同时表达 。CB F1 和 D R EB1A 的产物均为转录因子 , 它 们 与顺式作用重复元件 ( CR T) / (D R E) 结合 ,引起一组 含顺式作用重复元件 ( CR T) / ( D R E) 的功能基因表 达 。J aglo - Ot to sen 等27 将 CB F1 导入拟南芥 ,该基 因的过量表达明显提高了耐寒性 。Kasuga 等28 利 用 CaMV 35 S 启 动 子 和 逆 境 诱 导 特 异 启 动 子 rd29A ,将 D R EB1A 的 cDNA 导入拟南芥 , D R EB1A 的过 量 表 达 激 活 许 多 耐 逆 功 能 基 因 的 表 达 , 如rd29A (L EA 蛋白类似物) 、Kin 1 、Co r 6 . 6 、Co r 15a 、 rd17 和 P5CS 等 ,转基因植株耐旱性 、耐盐性和耐冻 性提高 。转 35 S 启动子 : :D R EB1A 基因植物在正常 生长情况下 D R EB1A 的过量表达使植株生长受到 严重抑制 。但如果用逆境诱导特异启动子 rd29A 启动子代替 35 S 启动子 ,对植株生长的影响很小 ,耐逆 性更高 。2 . 4解毒酶和氧化胁迫相关的酶 非生物胁迫通过引发氧化伤害影响植物的生长发育 。通过敏感性代谢反应提高清除氢氧自由基的能力 ,保护和稳定蛋白复合体和膜结构 ,这是提高植 物抗旱能力的又一个重要策略 。干旱导致豌豆产生 氧化胁迫 ,光合和蒸腾降低29 。Van Rensburg 等30 发现干旱胁迫诱导强耐旱性烟草的氧化胁迫相关基 因谷 胱 甘 肽 还 原 酶 、超 氧 化 物 歧 化 酶 和 asco rbate pero xidase 等大量表达 ,解毒酶和氧化胁迫相关酶的 活性也略有提高 。Tepper man 等31 将 Cu/ Zn 超 氧 化 物 歧 化 酶 ( SOD) 导入烟草和番茄使之过量表达 , 不影响转基 因植株的过氧化物毒害耐性 ; 然而 Gup ta 等32 发现 过量表达 Cu/ Zn - SOD 的转基因烟草在冷和高光胁 迫下保持了 90 %的光合能力 ,转基因植株的过氧化 物毒害耐性提高 。Bowler 等33 发现在叶绿体和线 粒体中定向过量表达 M n - SOD ,减轻了氧化胁迫对 细胞的伤害 。Van Camp 等34 报道转 Fe - SOD 烟草氧化胁迫相关的酶表达量提高 ,而对耐盐性响 。Mc Kersie 等35 37 报道转 M n - SOD 苜蓿 和耐冻能力提高 。Ro xas 等38 报道转 Nt 107 烟 冷和盐能力提高 。因此通过导入氧化胁迫诱导基因能否稳定地提高植物的抗逆能力还有许多 待做 。另外 ,将参与 Fento n 反应清除活跃的氢由基的胞内铁离子区隔化 ,能使转 ferritin 基因 耐氧化胁迫能力提高39 。存在问题与解决方法3综上所述 ,单基因转移能提高植物的抗旱性为植物抗旱分子育种带来了曙光 。但人们在通因工程方法进行抗旱分子育种的过程中发现存 些问题 : (1) 由于人们对植物抗旱的分子机制缺 解 ,抗旱分子育种的盲目性很强 ; ( 2) 采用单基 略提高植物的抗旱性对有的基因和植物有效 , 的基因和植物却无效 ; ( 3) 利用 35 S 启动子 : :抗 因组合在提高植物抗旱性的同时也造成植物畸 育 ; (4) 外源基因表达水平不稳定 。针对上述问题 ,我们认为应采取如下解决办(1) 加强植物抗旱分子机制的研究 ,这是提旱分子育种针对性和有效性的基础 ; ( 2) 采用多 基因 、主效功能基因和调节基因策略 。由于植 抗旱性是由多个功能基因控制的 ,如果采用单 策略 ,只有导入主效功能基因或调节基因 ,作用能明显 。否则只有采用多功能基因策略 ; ( 3) 利异启动子 。根是植物与外界环境进行信息和物 换的主要器官 ,在环境胁迫下最先受到影响的也是根 ,将根部特异启动子应用于抗旱基因工程使抗旱基因在根中特异表达 ; 另外逆境诱导特动子的应用也非常重要 ,从而使得抗旱基因在 来临时才表达 。上述两类特异启动子的应用可 降低能量消耗 ,使转基因植物在获得干旱抗性 时 ,又不影响正常的生长发育 , 从而可解决因35 S 启动子引起植物畸形发育的问题 ; ( 4) 提高 基因的表达水平 。外源基因插入的位置效应和数将影响转基因株系基因的表达水平 ,有时还 转化基因的低水平表达得出错误的结论 ,因此外源基因的表达水平十分必要 。要使导入植物的外源基因高水平表达可采取如下策略 : 使用动子 、组织特异性启动子和逆境诱导特异启动子用 MA R 序列 ( mat rix at tachment regio n) , 使用单拷贝的转基因株系以便减少基因沉默 ; ( 5) 检测转基因 植物的第 4 5 代以便验证导入基因是否稳定高水 平表达 ; (6) 使用纯合的转基因株系进行温室和田间 的耐旱性鉴定 。尽管目前抗旱分子育种面临不少问题 ,但随着抗旱分子生物学研究的深入和生物技术 的进步 ,我们相信在不久的将来会有大量的抗旱转 基因作物应用到生产实践中来 。1998 , 152 : 525532 .Pilo n - Smit s EA H , Ebskamp MJ M , Paul MJ , et al . 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