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生物化学实验绪论 生物化学实验课与理论课是两个不同的体系。理论课系统地介绍了各种生化分子的结构、性质、功能以及它们在生物体内的变化规律；实验课则要亲自动手验证理论的正确性，并通过学习各种物质的分离、鉴定方法进一步对理论有所发展。所以实验课要与理论课结合起来，互相补充，力求融会贯通，构建起系统的知识框架。一、教学目的与基本要求：1几大类生化物质的分离、定性、定量的研究方法及原理；2重要的生化分析方法及分离技术如：电泳、层析、离心、分光光度法等；3熟练规范地使用天平、离心机、分光光度计、电泳仪、水浴锅等仪器；4培养基本的实验设计能力，学会平行、对照、绘制标准曲线等基本的实验设计方法；5培养严谨、求实、创新的科学态度以及发现问题、解决问题的能力；6通过学习经典的实验设计，学会设计实验的基本思路和方法，培养从理论出发，设计实验，从而推出未知知识的能力。二、生物化学实验的要求及评分规则：（一）预习要求：1必须准备生化试验记录本，以备预习和课堂记录用；2实验前写好预习报告，并复习与实验相关的理论知识，熟悉本次试验的目的、原理、操作步骤等，懂得每一步操作的意义、了解所用仪器的使用方法；3未写预习报告或课堂记录不合格者，一律不准开始试验。若后来补上者，本次试验分数不超过60分。（二）操作要求：1实验课提前510分钟到，试验必须着实验服。试验台面不放置书包、衣物等。实验开始前，认真检查玻璃仪器的完好性及数目，若有损坏，立即报告。2实验过程中应严肃认真地按操作规程进行试验，仔细认真地观察试验现象，多思考、勤记录。把实验结果和数据及时、如实地记录记录在实验记录本上。实验完成后试验结果及记录经老师检查后才能离开。教师根据学生在实验课上的操作情况及试验结果和数据给出操作分。3使用仪器测样品时，用毕应认真填写使用记录。4实验现象和数据应如实记录，不准弄虚作假，改换数据。5实验台面应注意保持随时保持清洁，仪器、药品要排列有序，摆放整齐。公用试剂用毕应立即盖严放回原处。使用药品和试剂要注意节约，注意保持试剂和药品的纯净，严防混杂污染。使用和洗涤器皿时要小心、仔细，防止损坏，一旦损坏，应立即报告、登记。6维持课堂秩序，杜绝迟到、早退、旷课等现象。实验时着工作服，不到处走动。7废弃液体可倒入水槽内（强酸、强碱要稀释），并放水冲走。固体废物和带有沉淀的废物倒入垃圾桶内。8实验完毕，清洗干净器皿，桌面整理后方可离开。（三）实验报告1写出实验名称、目的和要求；2用简练语言准确记录实验操作步骤；3结果与讨论为重点内容，包括对实验设计的分析与借鉴，对实验数据的处理和计算，对实验现象的描述，结合实验原理对实验结果进行分析与讨论，对实验中所遇到的问题的探讨以及对实验的改进意见等。4能提出独到而合理的见解，或提出有建设性改进意见者，酌情加分。（四）值日要求1实验过程中水浴锅、电炉等的开关。2清扫教室并拖洗干净地面；3公用台面收拾整齐、擦干净。4倒垃圾、刷水池，领、还药品；5检查好水、电、门、窗，没有问题方可离开。（五）评分标准1预习给预习报告 10分2课堂操作 40分3实验报告 30分4最后考试 20分实验一、氨基酸纸层析一、 实验目的：通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、 实验原理：层析法是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差别，使各组分不同程度的分布在两个相中（一般为固定相和流动相），并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。用层析法可以分离性质极为相似、而用一般化学方法难以分离的各种化合物。纸层析是分配层析的一种，对在水和有机溶剂中都可溶的混合物可以用纸层析法分离。当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数。即分配系数：物质在溶剂中的浓度/物质在溶剂中的浓度。由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使水不易扩散。这样就把水吸附在纤维素上，成为固定相。有机溶剂可以沿滤纸移动，为流动相。当有机溶剂沿滤纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配。有一部分溶质离开原点上升，随有机相一起进入无溶质区域，这时又重新分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机溶剂不断流动时，溶质就沿有机相流动的方向不断进行分配。氨基酸的极性各不相同，与水的结合力不同，极性越强，与水的结合力越强，移动的距离越短；氨基酸极性越小，与水的作用力越小，移动的距离也越远。物质移动的距离与溶剂移动的距离之比就是Rf值。影响Rf值的因素包括：样品的性质、溶剂系统、纸、温度、pH、展层方式等。在一定条件下，某种物质的Rf值是常数。这样，根据Rf值的大小可以判断氨基酸的极性。三、 实验器材：序号仪器设备名称每组应配台件数现有台数耗材1层析缸1个2电吹风1个3毛细管4新华一号层析滤纸四、 实验试剂：1扩展剂：将100mL正丁醇中加入茚三酮0.1g，与25mL冰醋酸放入分液漏斗中，与75mL水混合，充分震荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂5mL置于烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。（用标本缸代替层析缸，每个加入扩展剂约180mL，每缸内放置两个滤纸筒。）1400mL2氨基酸溶液：0.5%赖氨酸、甘氨酸、缬氨酸及它们的混合液。五、 操作步骤：1画点样点：将手洗干净，取层析滤纸（1212cm），捏其边缘，置于白纸上。在层析滤纸上距一边2cm处用铅笔画一条直线，间隔2cm在直线上取1、2、3、4点。画线时注意不要将层析滤纸划破。2点样：用毛细管吸取10l赖氨酸，滴一滴于1上，然后用电吹风吹干，再滴再吹，直到将全部样品滴完。然后照样滴加甘氨酸、缬氨酸、混合样品各10l。（点3次比较合适）3扩展：将点样后的层析滤纸缝合呈筒状，两边不要接触，打开层析缸将其迅速放入扩展液中，使点样端朝下，没入约1cm，盖上层析缸，密闭放置，等到溶剂前沿距顶端约1cm时取出，并沿溶剂前沿用铅笔画一条直线。4由于扩展剂中已加入显色剂，所以直接用电吹风将层析滤纸吹干，干燥后在层析滤纸上不同位置处会显示几个色斑，用铅笔将其轮廓描出。5计算各层析斑的Rf值，并比较其大小。六、 注意事项：1取层析滤纸时，洗净手，捏边缘。2点样原则：少量多次，样斑不超过3mm。3滤纸筒缝合时，两边缘不要重叠。4展层溶剂不要没过点样点。思考题：1什么是Rf值？影响Rf值的因素有哪些？2层析缸中平衡溶剂的作用是什么？实验二、Bradford法测定蛋白质浓度一、 实验目的学习Bradford法测定蛋白质含量的原理和方法。二、 实验原理考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，酸性条件下与蛋白质结合以后变为青色，前者在465nm有最大吸收峰，与蛋白质结合以后在595nm波长处吸收增大。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质-色素结合物在595nm光吸收与蛋白质含量成正比，可用于蛋白质的定量测定。本法测定蛋白质浓度快速、灵敏、重复性好，适用于测定01000g/mL之间不同浓度的蛋白质溶液。三、试剂与仪器1仪器：72-1、2型分光光度计、离心机、分析天平、药物天平、10mL量筒、100mL容量瓶、移液管（1mL、0.1mL）、具塞试管、烧杯、漏斗、研钵2试剂及材料：（1）牛血清白蛋白标准溶液：称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中。即为1000g/mL的原液。（2）Bradford试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95%乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在室温下可放置1个月。（3）95%乙醇（4）85%的磷酸（5）鸡蛋清溶液：1：100倍，稀释后过滤四、操作步骤1考马斯亮蓝蛋白标准曲线的制定01000g/mL标准曲线的绘制：取6支试管，按下表的数据配制01000g/mL牛血清白蛋白溶液各1mL。管号1234561000g/mL牛血清白蛋白溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20蛋白质浓度（g/mL）02004006008001000准确吸取所配各管溶液0.1mL，分别放入比色管，再加入5mL考马斯亮蓝蛋白试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用10mm比色杯在595nm下比色，做出标准曲线。2样品蛋白质浓度的确定吸取提取液0.1mL于比色管中，加入5mL考马斯亮蓝蛋白试剂，充分混合，放置2min后用10mm光径比色杯在595nm处比色，记录消光值，并通过标准曲线查得每毫升溶液中蛋白质的含量，以蒸馏水做空白样。五、实验注意事项1反应时若出现细小颗粒，需摇匀。2测定试剂与蛋白质反应不得超过1小时，1小时后会产生小颗粒。3比色皿有蓝色粘附物时，可用40%乙醇或丙酮淋洗，或将比色皿浸在0.1N的盐酸中，几小时即可除去蓝色。4蛋白质与Bradford 试剂反应时只需轻轻混合即可，避免剧烈摇动，以防产生泡沫，降低颜色浓度。5 测定吸光值超出标准曲线最大浓度对应的吸光值时，把样液稀释后重新测定。实验三 总抗坏血酸含量的测定2，4-二硝基苯肼比色法一、原理总抗坏血酸包括还原型、氧化型抗坏血酸和二酮古乐糖酸。用溴或活性炭或吲哚使抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸，再转变为二酮古乐糖酸，最后使之与2，4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎，其含量与总抗坏血酸含量成正比，可进行比色，由标准曲线计算样品的含量。二、实验材料、仪器和试剂1实验材料白菜叶2仪器恒温水浴锅 分光光度计 试管 移液管 漏斗 20mL量筒 3试剂（1）2%草酸溶液：溶解20g草酸(H2C2O2)于700mL水中，稀释至1000mL。 （2）1%草酸溶液 稀释500mL2%草酸溶液到1000mL。 （3）标准抗坏血酸溶液：取100mg标准抗坏血酸溶解于1%草酸溶液中，定容至100mL。吸取50mL标准溶液加2.0g活性炭摇动1min，过滤，取5mL滤液，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液定容至500mL，此液浓度为10ug/mL。（4）2%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500mL50%乙醇溶液中。（5）85%硫酸溶液（6）2%2，4-二硝基苯肼溶液：溶解2g2，4-二硝基苯肼于100mL4.5mol/L硫酸内，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。（7）活性炭：将100g活性炭加到750mL 1mol/L盐酸中，回流12h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe3+)为止，然后置于110烘箱中烘干。检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。三、操作步骤1维生素C标准使用液的配制：见二3（1）2样品处理：称100g鲜样和100g2%草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆。取20g匀浆，以1%草酸溶液稀释，定容至100mL，转移到离心管中，然后以3000r/min离心10min。3样品氧化：取上清液25mL，加2.0g活性炭摇动1min，以3000r/min离心10min，取上清液10.0mL，加2%硫脲溶液10.0mL，混匀，得样品氧化液。4显色：取4只比色管，按下表加入试剂：管号12345名称空白对照标准对照1标准对照2样品管1样品管2样液（mL）4.0-4.04.0标准使用液-4.04.0-2，4-二硝基苯肼（mL）-1.01.01.01.0将所有试管放入370.5恒温箱或水浴中，保温3h。3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1.0mL2%2，4-二硝基苯肼溶液，在室温中放置1015min后放入冰水内。当试管放入冰水后，向每一试管中加入5mL 85 %硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。 比色：用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。 四、结果计算以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度(g/mL)为横坐标绘制标准曲线。计算 cV 100X=F . m 1000 式中：X-样品中总抗坏血酸含量，mg/100g；c一由标准曲线查得或由回归方程算得样品氧化液中总抗坏血酸 的浓度,g/ mL；V-试样用1%草酸溶液定容的体积，mL；F样品氧化处理过程中的稀释倍数；m试样质量，g。 13 结果的允许差 同一实验室平行或重复测定相对偏差绝对值10%。实验四、脂蛋白的分离琼脂糖凝胶电泳一、 实验目的1复习脂蛋白在体内的运输方式；2掌握琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白的方法。二、 实验原理血浆中的脂类都是以各种脂蛋白的形式存在的。由于载脂蛋白不同、分子量大小不同、表面电荷不同，在电场中各种脂蛋白的迁移速率不同，因此电泳后可将血浆脂蛋白分为若干区带。三、实验试剂1pH8.6巴比妥缓冲液（离子强度为0.05）：1.84g巴比妥、10.3g巴比妥钠用蒸馏水定容到1000mL。20.5%琼脂糖：用pH8.6凝胶缓冲液配制。317%牛血清清蛋白溶液：巴比妥缓冲溶液配置4染色液：苏丹黑无水乙醇饱和溶液。5新鲜血清四、实验器材1电泳仪：300600V（50100 mA）2水平式电泳槽：样品槽模板梳齿规格为101mm。五、操作步骤1血清预染：将苏丹黑B加到无水乙醇中至饱和，摇荡使乙酰化，用前过滤。血清0.2mL中加苏丹黑染色液0.2mL，混合置37水浴中染色20分钟，离心（2000转/分）约5分钟，以除去悬浮于血清中染料沉渣。2铺琼脂板及制作加样槽 1g琼脂加入200mL缓冲液中配制成0.5%溶液，置于电炉上加热溶解，冷却到5055，加入4mL17%的BSA（可以不加）。取一定量含清蛋白的琼脂糖倒入两端用胶带封住的槽内，使琼脂糖厚度为23mm，将样品槽模板（梳子）轻轻放入，室温下放置一段时间后，拆掉胶带，小心取出梳子，在凝胶面上即形成加样槽。3电泳槽的准备 在电泳槽中加入pH8.6巴比妥缓冲液，调节电泳槽使之水平。4加样 用微量进样器取10l血清小心加到槽中。5电泳 将加样后的凝胶板平放在电泳槽支架上，点样端靠近负极，稳压，把电流调到最大，电压调至100V，15min，然后将电压调至150v，通电近2小时。5固定染色及干燥 取出凝胶板，放在含固定液的培养皿中浸泡30min，用蒸馏水冲洗数次，然后倒干水，用滤纸吸去残余水分，再用电吹风吹干。最后将凝胶板置于玻璃板上室温风干。六、注意事项：1琼脂糖浓度为0.5%；2琼脂糖加热溶解后冷却到5055，铺板厚度为23mm；3正确连接正负极；4待样品进入凝胶约15min后，打开电源。电泳速度较慢，用冰浴冷却效果较好。每块胶板可做两组加样槽。实验五、植物DNA的提取和紫外分光光度法测定核酸含量一、 实验目的1学习提取植物组织中DNA的方法；2利用紫外线吸收法测定DNA的浓度二、 实验原理核酸是生物有机体的重要组分，在生物体内常同蛋白质结合成核蛋白的形式。DNA主要存在与细胞核中，RNA主要存在于细胞质和核仁中。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白释放出来。在浓氯化钠溶液（12mol/L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；在稀氯化钠溶液（0.14mol/l）中，正好相反。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质去除，常采用的去除蛋白质的方法有三种：（1）用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，DNA则留在上层水相中。用两倍体积的95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。（2）用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA；（3）用苯酚处理，然后离心分层，蛋白质留在苯酚层中，DNA或溶于上层水相，或存在于中间残留物中。将其吸出，注入2倍体积的95%乙醇，可以得到白色纤维状沉淀。反复使用上述方法多次处理就可以将蛋白质等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了除去其中的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分多糖，再用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，对紫外光在260nm处有强烈吸收峰。在260nm处，每毫升含1gDNA的溶液的光吸收值为0.020；每毫升含1gRNA溶液的光吸收值为0.022。只要测定未知浓度RNA或DNA溶液的A260即可计算出其中的核酸含量。蛋白质也能吸收紫外光（酪氨酸、色氨酸），蛋白质对紫外光的吸收高峰在280nm处，而在260nm处的吸光值很小。RNA：A260/ A2802.0；DNA：A260/ A2801.9。根据比值，可确定核酸的纯度。三、 实验器材离心机、离心管、紫外分光光度计、分析天平、恒温水浴、研钵、烧杯、移液管（5mL2支、1mL1支）、试管及试管架、量筒（25mL、10mL）、玻棒。四、 试剂和材料15mol/LNaCl溶液：292.3g氯化钠溶于水，并稀释至1000mL。20.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA-Na溶液（稀盐溶液）：将8.18NaCl及37.2gEDTA-Na溶于蒸馏水中，稀释至1000mL。320%SDS溶液：将25gSDS溶于100ml 45%乙醇溶液中。495%乙醇溶液5二苯胺试剂：1.0g二苯胺溶于100mL冰乙酸，再加入2.75mL浓硫酸。用前配制。五、操作步骤1核蛋白的制备：将黄豆中子剥去子叶、取胚芽、胚轴、胚根部分1g置于研钵中，用0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA-Na溶液洗12次，然后加入2mL该稀盐溶液和少许石英砂，研磨成匀浆，转入离心管中，用8mL稀盐溶液分洗研钵3次，都转入离心管，以3000r/min离心10min后，弃去上清液，用稀盐溶液小心冲洗沉淀12次，除净白色脂肪。2DAN与蛋白质分离：在含有DNA核蛋白沉淀的离心管内加入5mL稀盐溶液，用玻棒小心搅拌，使沉淀悬浮，然后滴加20%SDS溶液1mL，边加边轻轻搅拌。然后，置于60水浴中保温10min，并不停地轻轻搅拌，然后取出冷却至室温。3DNA粗制品的提取：向上述溶液中加入5mol/LNaCl溶液2mL，使NaCl溶液最终浓度约1mol/L，然后慢速轻轻搅拌10 min，以3000r/min离心10min后，弃去沉淀（主要是蛋白质），收集上清液于小烧杯中，加入1.5倍体积的95%乙醇，边加边用玻棒慢慢搅出DNA纤维状细丝，将其收集在干净试管中，即得DNA粗制品。4DNA粗制品的进一步纯化：将上述DNA粗制品溶于8mL稀盐和2mL浓盐溶液的混合溶液中，再加入1倍体积的氯仿异戊醇溶液，振荡5min，以3000r/min离心15min。倾出最上层清液于另一离心管，加入1.5倍体积95%乙醇，DNA沉淀析出。离心，弃去上清液。将沉淀溶于8mL稀盐和2mL浓盐溶液的混合溶液中，然后徐徐加入2倍体积的95%乙醇溶液，边加边轻轻搅出丝状DNA。5二苯胺法检测DNA：向上述试管中加入二苯胺试剂2.0mL，沸水煮10min，观察颜色变化。（5把丝状DNA转入试管中，用少量丙酮浸泡后脱水干燥，贴标签，置于冰箱中，待用。6用准确称取所得DNA，将其放入干净试管中，加入23滴0.01mol/L的NaOH调成糊状，加入适量水，配成溶液。用56%氨水调节pH值为7.0，稀释适当倍数（可先测母液的A260，若此值小于0.5，可不用稀释）。7将所得溶液在波长分别为260nm，280nm处用紫外分光光度计测吸光值。8核酸浓度的计算 DNA浓度为（g/mL）：（A260/0.020L）N其中，L为比色杯厚度（1cm），N为稀释倍数。）实验六、酶的特性一、目的：加深对酶的性质的认识二、内容：温度对酶活力的影响；pH对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制剂；（一）温度对酶活力的影响1原理：酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度是3740，植物酶的最适温度是5060。酶对温度的稳定性与其存在形式有关（干燥制剂，溶液）。低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。2器材：试管及试管架、恒温水浴、冰浴、沸水浴、量筒3试剂和材料：（1）0.2%淀粉的0.3%氯化钠溶液 150mL（2）稀释20倍的唾液：用蒸馏水漱口，再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量筒并稀释20倍，混匀备用。（3）碘化钾-碘溶液：将碘化钾20g及碘10g溶于100mL水中，使用前稀释10倍。4操作：取3支试管，编号后按下表加入试剂：管号123淀粉溶液（mL）稀释唾液（mL） 煮沸过的稀释唾液（mL）1.51-1.51-1.5-1摇匀后，将1、3号试管放入37恒温水浴中，2号管放入冰浴中。10min后取出，将2号管液体分为两半，用碘化钾-碘溶液来检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度。将2号管内剩下的一半溶液置于37水浴中继续保温10分钟后，再用碘液检验。（二）pH对酶活力的影响1原理：酶的活力受环境pH的影响极为显著。不同酶的最适pH不同。唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。2器材：试管及试管架、吸管、滴管、50mL锥形瓶、恒温水浴3试剂和材料：（1）0.5%淀粉的0.3%氯化钠溶液 150mL（2）稀释20倍的唾液：用蒸馏水漱口，再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量筒并稀释20倍，混匀备用。100mL（3）0.2mol/L磷酸氢二钠溶液600mL（4）0.1mol/L柠檬酸溶液400mL（5）碘化钾-碘溶液 50mL（6）pH试纸：5、5.8、6.8、84操作：（1）取四个锥形瓶并编号，按以下操作：锥形瓶号码0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（mL）0.1mol/L柠檬酸溶液（mL）pH12345.156.057.729.724.853.952.280.285.05.86.88.0（2）从4个锥形瓶中各取缓冲液3mL，注入4支编号的试管中，并向试管中加入淀粉溶液2mL和唾液2mL。各管添加唾液的时间隔为1分钟。混匀后，置于37保温。（3）第三管保温3分钟后，每隔1分钟取出一滴混合液，置于白磁板上，加一小滴碘化钾-碘溶液。待混合液为棕黄色时，向所有试管加入12滴碘化钾-碘溶液。添加的时间隔为1分钟。（1） 观察各管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。（三）唾液淀粉酶的活化和抑制1原理：酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。2器材：恒温水浴、试管及试管架3试剂和材料：（1）0.1%淀粉溶液 150 mL（2）稀释20倍的唾液 150 mL（3）1%氯化钠 50 mL（4）1%硫酸铜 50 mL（5）1%硫酸钠 50 mL（6）碘化钾-碘溶液 150 mL4操作：管号1234稀释20倍的唾液溶液（mL）0.50.50.50.51%氯化钠溶液（mL）0.5-1%硫酸铜溶液（mL）-0.5-1%硫酸钠溶液（mL）-0.5-蒸馏水-0.50.1淀粉溶液溶液（mL）1.51.51.51.537恒温水浴保温10分钟。碘化钾-碘溶液（滴）23232323现象三、注意事项1注意保证各管反应时间一致2各管加液后要摇匀4号加水管的反应程度高于硫酸钠管，原因未知。实验七、鲤鱼消化道蛋白酶的研究一、实验目的1学习蛋白酶的测定方法；2研究鲤鱼蛋白酶的最适pH值。二、实验原理Folin试剂是磷钨酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色。酪蛋白经蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与酚试剂反应，所生成的蓝色化合物在680nm处有最大吸收峰，可用分光光度法测定。三、实验器材鲤鱼肠道（一条鱼/4组），解剖工具，冰盘、TGL高速冷冻离心机、72-2型分光光度计、水浴锅、培养箱、试管、烧杯，移液管四、试剂1 Folin试剂 2 0.55mol/L碳酸钠溶液 500mL/4组3 10%三氯乙酸溶液 200mL/4组4 0.5%酪蛋白溶液 100mL/4组称取酪蛋白2.5g，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液4mL润湿，加蒸馏水少许，在水浴中加热溶解。冷却后，用蒸馏水定容至500mL。50.02mol/L磷酸盐缓冲液见指导书278页，先配制0.2 mol/L磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠各100 mL/4组，按比例配制成pH值为6.27.8、幅度为0.4的磷酸缓冲液10mL，然后分别稀释10倍后，配制0.02mol/L磷酸缓冲液。6100g/mL酪氨酸溶液精确称取烘干的酪氨酸100mg，用0.2mol/L盐酸溶液溶解，定容至100mL，临用时用水稀释10倍。五、操作步骤1酶粗提液的制备：解剖鲤鱼，取出消化道，挤出内容物，用蒸馏水冲洗数次，分为前、中、后三段，分别吸干、称取2.0克左右，剪开肠壁，用玻片刮取肠道粘膜在覆盖保鲜膜的冰盘上操作，置于研钵中，加入2mL0.02mol/L、 pH值为7.0的磷酸缓冲液匀浆。匀浆液于4，以10000r/min的速率离心20min（离心机不能制冷，常温离心，10min），收集上清液，即为酶粗提液，稀释至7mL后，置于4保存、待测。解剖在冰盘上进行，整个过程在35条件下进行。2酪氨酸标准曲线的制作（1）取7支试管编号，按下表操作。管号1234567酪氨酸mL00.10.20.30.40.50.6水mL1.00.90.80.70.60.50.4酪氨酸浓度g/mL0102030405060（2） 混匀后，向各试管分别加入碳酸钠溶液5.0mL。（3） 混匀后，向各试管分别加入酚试剂1.0mL。（4） 30水浴15min后，取出，在680nm下测定吸光值。3蛋白酶活性的研究：（1）样品组按以下操作：每个pH梯度取3支试管，依次加入酪蛋白溶液1.0mL，相应pH值的磷酸缓冲液1.5mL，酶粗提液0.5mL，混匀后于30保温10min。取出，加入10%三氯乙酸1.5mL以终止反应。静置10min后，于2000r/min离心10min。（2）对照组按以下操作：每个pH梯度取3支试管，依次加入酶液0.5mL，三氯乙酸1.5mL，混匀后，加入相应pH值的磷酸缓冲液1.5mL，再加入酪蛋白溶液1.0mL，混匀后于30保温10min。取出，于2000r/min离心10min。（3）显色 取离心后的上清液1.0mL，分别加入碳酸钠溶液5.0mL，混匀后，向各试管分别加入酚试剂1.0mL，30水浴15min后，取出，在680nm下测定吸光值。空白管见标准曲线的制作。六、酶活力的计算规定在30每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸为一个酶活力单位。则每克鲤鱼肠道组织的酶活力为：（A样-A对）KVN/（tm）式中: A样为样品液光吸收值；A对为对照液光吸收值；K为标准曲线上光吸收为1.0时的酪氨酸g数；V为酶促反应管的总体积，本实验为4.5mL；N为酶粗提液体积与参与反应酶粗提液的体积比，本实验为14倍；t为酶促反应的时间，本实验为10min；m为剪取的肠道组织质量（g）实验八 鳑鲏鱼繁殖季节体色的变化研究薄层层析法一、实验目的1学习薄层层析法的原理和方法；2.研究鳑鲏鱼繁殖季节体色改变的呈色物质。二、实验原理薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01g）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。另外，薄层层析操作方便，层析时间短，可分离各种化合物，比纸层析灵敏度高10100倍，显色和观察结果方便。薄层层析的主要原理是，根据样品组分与吸附剂的吸附力及其在展层溶剂中的分配系数的不同而使混合物分离。当展层溶剂移动时，会带着混合样品中的各组分一起移动，并不断发生吸附与解吸作用以及反复分配作用。根据各组分在溶剂中溶解度不同和吸附剂对样品各组分的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列的斑点。如果把标准样品在同一层析薄板上一起展开，便可通过在同一薄板上的已知标准样品的Rf值和未知样品各组分的Rf值进行对照，就可初步鉴定未知样品各组分的成分。 将吸附剂或支持剂按各单体所规定的量，放入适当容器，加入适量水以配成悬浮液，在厚度均匀一致的平滑玻璃板上将此悬浮液均布成0.25mm的厚度，风干后一般在110下干燥0.5-1h（或按单体规定）。以离薄层板一端约50mm的位置作为点样基线，用微量吸管按规定量吸取试样液和对照（标准）液，点于基线上，点与点之间的距离在10mm以上，液点的直径约3mm，风干后，基线一端向下，将薄层板放入展开溶剂，溶剂层深10mm，并预经展开溶剂的蒸汽饱和。在展开溶剂从基线上升至规定距离（一般为15cm）后，取出薄层板，风干，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色。然后按规定的方法，对斑点的位置和颜色进行检查。三、分组：每4个小组为一大组，其中每个小组有1个时段的鱼一条，各小组分别制样，点样时每板点本大组的4个样。四、实验器材薄层层析硅胶板（5cm10cm）；层析缸；毛细管；电吹风；电炉；分液漏斗；解剖工具；匀浆器、离心机等。五、试剂和材料：1.材料：鳑鲏鱼2.试剂：（1）展层剂：石油醚丙酮正丙醇= 90100.45（2）饱和NaCl溶液（3）无水NaCO3（4）石油醚（5）丙酮（6）10%硫酸溶液六、操作步骤：1解剖鱼，取出内脏，生殖腺和消化道分别保存在波恩氏液和福尔马林溶液中，备用。称取鱼体 (去除内脏) 4.0g ，放入洁净的研钵内，加入0.8g 无水硫酸钠，匀浆。2加入20mL 丙酮和5mL 石油醚抽提1 次，再用3mL 丙酮和7mL 石油醚连续抽提3 次，将每次所得提取液先后吸入洁净的离心管中离心(5000r/min) 5min。3将上清液移入分液漏斗中，加入等体积的饱和食盐水溶液，轻轻振荡，静置分层，放掉下层的水、丙酮和盐溶液层。并用蒸馏水冲洗色素石油醚层6 7 次，以彻底洗去丙酮和盐。4。将色素石油醚提取液风干浓缩，然后在浓缩物中加入1mL 石油醚溶剂将其溶解，并用毛细玻璃管在已制好的硅胶薄层板上点样，每组1板，点4点。5将点好样的薄层板放入盛有25mL 展层剂，并封闭15min 的层析缸中层析。6待溶剂前沿距上边1cm左右时，取出。样品浓度高时，可见色斑，如浓度较低，可以过硫酸溶液、烤干显色，计算Rf值。实验九、小麦萌发前后还原糖和淀粉酶活力的测定一、 实验目的1学习测定还原糖和淀粉酶活力的方法；2研究小麦萌发前后还原糖和淀粉酶活力的变化二、 实验原理种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在，淀粉等多糖是非还原糖，单糖都是还原糖，寡糖有一部分是还原糖。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖，麦芽糖有还原性，能使3，5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5硝基水杨酸。后者可用分光光度计法测定。休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着萌发天数的增长而增加。三、 实验器材离心机、离心管、分光光度计、恒温水浴、吸管、试管等。四、 试剂和材料（一）还原糖的