功能评价的程序与方法.doc

食品功能评价的程序与方法食品科学 李博轩0408014摘要：本文介绍了评价功能食品的免疫调节、延缓衰老、改善记忆、促进生长发育、抗疲劳、减肥、调节血脂、耐缺氧、抗辐射、抗突变、抑制肿瘤、改善性功能等作用的基本方法和要求，同时介绍了评价功能性食品保健作用的人体试食试验规程。关键词：功能评价 动物实验1. 评价功能性食品保健作用的基本要求1.1 对受试物的要求（1）提供受试物的物理、化学性质(包括化学结构、纯度、稳定性等)等有关资料。（2）受试物必须是规格化的产品，即是符合既定的生产工艺、配方及质量标准，受试物的纯度应与实际应用的相同。（3）提供受试物安全性毒理学评价的资料受试物必须是已经过食品安全性毒理学评价确认为安全性物质。1.2 对实验动物的要求（1）根据各种试验的具体要求，合理选择动物。常用大鼠和小鼠，品系不限，推荐使用近交系动物。（2）动物的性别不限、可根据试验需要进行选择。动物的数量要求为小鼠每组至少10只(单一性别)，大鼠每组至少8只(单一性别)：动物的年龄可根据具体试验需要而定，但一般多选择成年动物。（3）动物应达到二级实验动物要求1.3 给受试物的剂量及时间 （1）各种试验至少应设3个剂量组l个对照组必要时可设阳性对照组。剂量选择应合理，尽可能找出最低有效剂量。在3个剂量组中，其中一个剂量组应相当于人推荐摄人量的5l0倍左右。 （2）给受试物的时间应根据具体试验而定，原则上至少1个月。2. 试验的基本原则与结果判定2.1 免疫调节作用2.1.1 试验项目（1）动物试验脏器/体重 比值；胸腺/体重 比值；脾脏/体重 比值细胞免疫功能测定；小鼠脾淋巴细胞转化试验；迟发型变态反应体液免疫功能测定；抗体生成细胞检测；血清溶血素测定单核巨啦细胞功能测定；小鼠碳廓清试验；小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验NK细胞活性测定人体试食试验细胞免疫功能测定；外周血淋巴细胞转化试验体液免疫功能试验；单向免疫扩散法测定IgG.IgA.IgM单核巨噬细胞功能测定；吞噬与杀菌试验NK细胞活性测定2.1.2 试验原则要求选择一组能够全面反映免疫系统各方面功能的试验，其中细胞免疫、体液免疫和单核巨噬细胞功能三个方面至少各选样1种试验，在确保安全的前提下尽可能进行人体试食试验。2.1.3 结果判定 在一组试验中，受试物对免疫系统某方面的试验具有增强作用而对其他试验无抑制作用，可以判定该受试物具有该方面的免疫调节效应；对任何一项免疫试验具有抑制作用可判定该受试物具有免疫抑制效应。在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核、巨噬细胞功能及NK细胞功能检测中，如有两个以上(含两个)功能检测结果阳性、即可判定该受试物具有免疫调节作用。2.2 延缓衰老作用2.2.1 试验项目(1)动物试验生存试验：小鼠生存试验；大鼠生存试验；果蝇生存试验过氧化脂质含量测定：血(或组织)中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定；组织中脂褐质含量测定抗氧化酶活力测定：血(或组织)中超氧化物歧化酶(SOD)活力测定；血(或组织)中谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)活力测定(2)人体试食试验 血中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定；血中超氧化物歧化酶(SOD)活力测定 血中谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)活力测定2.2.2 试验原则 衰老机制比较复杂，迄今尚无一种公认的衰老机制学说，因而无单一、简便、实用的衰老指标可供应用，应采用尽可能多的试验方法，以保证试验结果的可信性。动物试验，除上述生存试验、过氧化脂质含量测定、抗氧化酶活力测定3个方面各选一项必做外，还可以选择一些指标如脑、肝组织单胺氧化酶(MAOB)活力仪测定等加以辅助。生存试验是最直观、最可靠的试验方法，果绳具有生存期短、繁殖快、饲养简便等优点，通常多选果蝇作生存试验，但果蝇种系分类地位与人较远，故必须辅助过氧化脂质含量则定及抗氧化酶活力测定才能判断是否具有延缓衰老作用。生化指标测定应选用老龄鼠，陈设老龄对照组外，最好同时增设少龄对照组以比较受试物抗氧化的程度，必要时可将动物试验与人体试食试验相结合综合评价。2.2.3 结果判定若大鼠或小鼠生存试验为阳性，即可判定该受试物具有较强延缓衰老的作用。若果蝇生存试验、过氧化脂质和抗氧化酶三项指标均为阳性，即可判定该受试物具有延缓衰老的作用。若过氧化脂质和抗氧化酶两项指标均为阳性，可判定该受试物具有抗氧化作用，并提示可能具有延缓衰老作用。2.3 改善记忆功能2.3.1试验项目（1)动物试验：跳台试验；避暗试验；穿梭箱试验；水迷宫试验（2)人体试食试验：韦氏记忆量表；临庆记忆量表2.3.2试验原则 (1)试验应通过训练前、训练后及至测验前等3种不同的给予受试物方法观察其对记忆的全过程(记忆的获得、记忆巩固、记忆再现)的影响。 (2)应采用一组(2个以上)行为学试验方法，以保证试验结果的可靠性。 (3)人体试食试验为必做项目，并应在动物试验有效的前提下进行。试验对象可以是婴幼儿、儿童、弱智、成人或老年人。 (4)除上述试验项目外，还可以选用嗅觉厌恶试验、味觉厌恶试验、操作式条件反射试验、连续强化程序试验、比率程序试验、间隔程序试验。2.3.3 结果判定 动物试验2项或2项以上的指标为阳性，且2次或2次以上的重复测试结果一致可以认为该受试物具有改善该类动物记忆作用。 若人体试食试验结果阳性，则可认为该受试物具有改善人体记忆作用。2.4 促进生长发育作用2.4. l 试验项目 (1)胎仔倩况；活胎数、雌雄比例、死胎数、分娩胎仔总数。 (2)体重及食物利用率：记录出生时及生后4、7、14、21、30、60d幼鼠的体重，计算断乳后幼鼠的食物利用率。 (3)发育指标：记录耳廓分离、门齿萌出、开服、长毛时间。 (4)神经反射指标：平面翻正、前肢抓力、悬崖回避、嗅觉定位、听觉警觉。2.4.2 试验原则(1)给受试物试验的时间可根据具体情况选择在母鼠孕期、哺乳期或仔鼠断乳至成年期。(2)观察指标除上述之外，还可以观察阴道开放、宰丸下降时间、负趋地性、回旋运动、视觉发育、空中翻正、游泳发育等指标。2.4.3 结果判定试验项目中3项或3项以上指标为阳性，可认为受试物有促进生长发育的作用。2.5 抗疲劳作用2.5.1 试验项目(1)负重游泳试验；(2)爬杆试验；(3)血乳酸；(4)血清尿素氮；(5)肝肌糖原测定。2.5.2 试验原则 运动试验与生化指标检测相结合。在进行游泳或爬杆试验前，动物应进行初筛、以上生化指标外，还可检测血糖、乳酸脱笺酶、血红蛋白以及磷酸肌酸等指标。2.5.3 结果判定若1项以上(含1项)运动试验和2项以上(含2项)生化指标为阳性，即可以判断该受试物具有抗疲劳作用。2.6 减肥作用 2.6.1 减肥原则(1)减除体内多余的脂肪，而不单纯以体重减轻为标准，要观察脂肪减少的程度。(2)每日营养素的摄入量应基本保证机体正常生命活动的需要。不要过分节食以增加减肥速度，因为急剧减少饮食量所降低的体重，除脂肪外，大部分是水分和肌肉，实际上脂肪的消耗速度是缓慢的。(3)对健康无损害，无不良反应(如厌食、胃肠功能紊乱、体力下降、头晕、腹泻、脱发等)。2.6.2 试验项目(1)营养性动物肥胖模型法 体重；体内脂肪重量(全身或腹腔内、生殖器及肾周围）；脂肪细胞数目及大小测定；血脂测定(血清甘油三酯及总胆因醇)(2)入体试食试验体重；体内脂肪百分率测定或皮脂厚度测定；血脂测定(血清甘油三酯及总胆固醉)2.6.3 试验原则在进行减肥试验时，除以上试验项目必测外，还应进行机体营养状况的检测(如血红蛋白、白蛋白、球蛋白等)，运动耐力的测试以及不良反应的观察(如厌食、胃肠功能紊乱、腹泻等)。入体试食试验为必做项日。动物试验与人体试验相结合，综合进行评价。2.6.4 结果判定在动物试验4个指标中，有2个以上指标阳性(含2个，且其中一个指标应是体内脂肪重量)，并且无不良影响，即可初步判定该受试物具有减肥作用。在人体试验中、体内脂肪量显著减少，且对机体健康无损害，可判定该受试物具有减肥作用。2.7 耐缺氧作用2.7.1 试验项目小鼠常压耐缺氧试验2.7.2 结果判定耐缺氧试验阳性，说明该受试物具有耐缺氧作用2.8抗辐射作用2.8.1 试验项目(1) 亚急性试验 30d存话率试验；白细胞总数(2) 亚慢性或慢性试验 小鼠睾丸染色体畸变分析； 小鼠骨髓细胞微核试验2.8.2 试验原则 较高剂量一次辐射,选择亚急性试验,小剂量多次试验或长期辐射,选择亚慢性或慢性试验。2.8.3 结果判定 亚急性试验项目中有2项结果为阳性，则可判定该受试物对较高剂量一次辐射有拮抗作用。 亚慢性或慢性试验中有2项结果为阳性，则可判定该受试物对小剂量多次辐射有拮抗作用.2.9 抗突变作用2.9. 1试验项目 Ames试验或V79细胞基因突变试验 小鼠骨髓细胞微核试验 小鼠睾丸染色体畸变分析2.9.2试验原则Ames试验或V79细胞基因突变试验任选一项。采用体内或体外试验相结合的原则。2.9.3结果判定抗突变三项试验中有两项为阳性时，则可判定该受试物具有抗突变作用。2.10 抑制肿瘤作用2.10.1 试验项目(1)动物诱发性肿瘤试验(2)动物移植性肿瘤试验(3)免疫功能试验：NK细胞活性测定；单核巨噬细胞功能测定2.10.2 试验原则 动物诱发性肿瘤试验及动物移植性肿瘤试验两项中任选一，同时必做2项免疫功能试验2.10.3 结果判定动物诱发性肿瘤试验及动物移植性肿瘤试验两项试验中有一项为阳性，并且对免疫功能无抑制作用，则可判定该受试物具有抑制肿瘤的作用。2.11 调节血脂作用2.11.1 试验项目 大鼠脂代谢紊乱模型；人体试食试验2.11.2 试验原则动物试验与人体试食试验相结合2.11.3 结果判定大鼠脂代谢紊乱模型法：结果为阳性时可初步判定该受试物具有调节血脂作用。人体试食试验法：结果为阳性时，可判定该受试物对高脂血症人具有调节血脂作用。2.12 改善性功能2.12.1 试验项目(1)交配试验 大鼠交配试验；小鼠交配试验(2)勃起试验2.12.2 试验原则 评价改善性功能作用，应主要观察是否增强性交功能及阴茎勃起功能。考虑到影响性功能的因素很多，而睾酮对性功能的维持具有重要意义，必要时可对血清睾酮水平进行测定。2.12.3 结果判定交配试验和勃起试验中有一项试验结果为阳性，即可判定该受试物具有改善性功能的作用。3 影响因素3.1 人的可能摄入量，除一般人群的摄人量外，还应考虑特殊的和敏感的人群(如儿童、孕妇及高摄入量人群)3.2