实验八聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳课件

实验八 聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳 目的与要求掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质的原理 熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法和操作技术 实验原理 电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象 电泳技术根据支持物的不同可分为 纸电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 淀粉凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等 经凝胶形状分 水平平板电泳 圆盘柱状电泳及垂直平板电泳 水平板式电泳槽 垂直板式电泳槽 柱状电泳槽 电泳分离原理 在电场中 推动带电质点运动的力 F 等于质点所带净电荷量 Q 与电场强度 E 的乘积 F QE质点的前移同样要受到阻力 F 的影响 对于一个球形质点 服从Stoke定律 即 F 6 r 式中r为质点半径 为介质粘度 为质点移动速度 当质点在电场中作稳定运动时 F F 即QE 6 r v 聚合反应是由溶于水的AP产生自由基S2O8 SO4 自由基SO4 催化TEMED使之成为带不成对电子的活化分子 活化的TEMED可随机与Acr分子或Bis分子结合并转移自由基使之活化 被活化的Acr可以同样的方式结合另一分子Acr并转移自由基使其活化 如果反应物中只有Acr分子 按反应机理可以使所有Acr分子结合成长链 使其末端的Acr分子始终带有被转移的自由基活性 但仅Acr分子的多聚体只能形成长链 尽管呈黏稠状 但不能形成带孔的凝胶 Bis是由两个Acr分子靠甲叉基相互连接构成 Bis中的两个丙烯酰胺都可以分别被TEMED活化成为活化分子 而后又去不断地结合和活化其他Acr分子 形成长链 或者分别被已形成长链的Acr活化连接 或者一边被TEMED活化后与Acr形成长链 另一边与已合成的Acr长链结合等 其反应是随机的 多样的 但无论如何反应 在形成的Acr长链之间由于Bis的纵链而被连接起来 形成立体的网状结构 Bis是一种引入纵链的交联剂 这样 按一定比例的Acr和Bis在TEMED AP的作用下就形成具有立体多孔 多分枝网状结构的聚丙烯酰胺凝胶 丙烯酰胺 Acr 交联剂 甲叉双丙烯酰胺 Bis 催化剂 过硫酸铵 化学法 核黄素 光化法 活化剂 TEMED N N N N 四甲基乙二胺 C 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 系统的不连续性表现在以下几个方面 1 凝胶由上 下两层凝胶组成 两层凝胶的孔径不同 上层为大孔径的浓缩胶 下层为小孔径的分离胶 2 缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同 电极缓冲液为pH8 3的Tris 甘氨酸缓冲液 浓缩胶为pH6 7的Tris HCl缓冲液 而分离胶为pH8 9的Tris HCl缓冲液 3 在电场中形成不连续的电位梯度 在这样一个不连续的系统里 存在三种物理效应 即样品的浓缩效应 凝胶的分子筛效应和电荷效应 由于这三种物理效应 使样品分离效果好 分辨率高 8 3 6 7 8 9 8 3 浓缩效应 样品在电泳开始时 通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层 一般能浓缩几百倍 然后再被分离 当通电后 样品进入浓缩胶中 解离度最大的cl 有效迁移率最大 被称为快离子 解离度次之的蛋白质则尾随其后 解离度最小的甘氨酸离子 PI 5 97 泳动速度最慢 被称为慢离子 由于快离子的迅速移动 在其后边形成了低离子浓度区域 即低电导区 电导与电势梯度成反比 因而在快 慢离子间形成了局部较高的电位梯度 处于该高电位梯度下的血清蛋白质各成分以不同速度 分子量和带电量不同 泳向快离子区 后又急速减慢 因而就按其分子的大小堆积浓缩成层 电荷效应 当各种离子进入pH8 9的小孔径分离胶后 甘氨酸离子的电泳迁移率很快赶上蛋白质 高电势梯度也随之消失 在均一电势梯度和pH的分离胶中 由于各种蛋白质的等电点不同 所带电荷量不同 在电场中所受引力亦不同 经过一定时间电泳 各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带 分子筛效应 由于分离胶的孔径较小 分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时 所受阻滞的程度不同 故因迁移率不同而被分离 此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时 受阻滞的程度不同 小分子走在前面 大分子走在后面 各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种 化学聚合 AP 光聚合 核黄素 用核黄素进行光聚合的优点是 核黄素的用量很低 通过光照可以预定聚合时间 但光聚合的凝胶孔较大 而且随时间延长而逐渐变小 不太稳定 所以用它制备大孔凝胶较适合 化学聚合的凝胶孔径较小 因而采用过硫酸胺 TEMED催化系统制备小孔凝胶 分离胶 而且各次制备的重复性好 考马斯亮蓝Coomassiebrilliantblue 在蛋白质染色中 目前考马斯亮蓝染色法最为常用 1965年考马斯亮蓝应用于聚丙烯酰胺凝胶染色 它步骤简便 灵敏度较高 可进行定量扫描 它可分为R和G型两类 R250比考马斯亮蓝G250少二个甲基 但是比G250灵敏度高 染色原理 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基通过范德华力结合 在595nm下测得的吸光度 与蛋白质浓度成正比 试剂及器材 两种胶的储备液 电极缓冲液 染色液 脱色液 凝胶电泳玻璃管 注射器 10cm长注射针头 微量取样器 圆盘电泳槽 电泳仪 0 05 溴酚蓝 马血清 40 蔗糖溶液 实验操作 将洁净烘干的玻璃管一端用胶布封好 插入疫苗瓶的橡皮帽上 将封闭的一端朝底垂直放于试管上 分离胶和浓缩胶 每八人配一份 分离胶 1 先配制分离胶 在干燥小烧杯中加入1 2号液及水分别为1ml 2ml和1ml 混匀2 加入新配制的过硫酸铵4ml 混匀及时用滴管吸取胶液沿管壁灌入玻璃管内具管口约1 5cm处 3 立即顺管壁加入水 以隔绝空气中的氧 加速胶凝过程 加水时一定要防止搅乱胶面 4 待约30min即凝集成胶 弃去顶上水层 可用吸水纸吸干 浓缩胶 1 按表配制浓缩胶 在干燥小烧杯中先加入4 5 7号液分别为1ml 2ml和4ml 混匀 2 再加入6号液1ml混匀 用少量该胶液冲洗分离胶面 然后用吸管吸取该胶液沿壁灌入分离胶面上层距管口约0 5cm处 3 迅速小心沿壁加入水层 置胶管于日光灯下照射 进行光化作用 约30min后聚合完全 待胶凝好后 将封闭物取下 将胶管安到电泳槽中 倒上缓冲液 检查是否漏液 液面要过管顶 点样 取血清100 l 40 蔗糖100 l 溴酚蓝100 l于白磁盘中混匀 上样15 l 电泳 浓缩胶时电压80V 约40min 分离胶160V 约3h 待溴酚蓝快到管口时停止电泳 倒出缓冲液 取胶 带长针头的注射器吸水 沿管壁慢慢插入同时注水 慢慢转动 胶会慢慢滑出或用洗耳球吹出于试管中 不要用力过猛 且试管应先放些水 以防止胶断裂 染色 将试管里水倒掉