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病毒 致病 机理 及其 检测

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此文档收集于网络，如有侵权，请 联系网站删除 食品微生物学进展课程论文 题 目： 朊病毒的致病机理及其检测 姓 名： 费鹏 学 号 2011309110056 专 业： 粮食、油脂和植物蛋白工程 指导教师： 陈福生 职 称 教授 中国武汉 二○一二 年 一 月 朊病毒的致病机理及其检测 摘 要：朊病毒病是人和动物的一种致死性的神经系统退行性疾病，主要包括羊骚痒病，疯牛病，以及人的克—雅氏综合症。其致病因子被认为是一种由正常细胞PrP蛋白经非正常折叠所形成的蛋白质（PrPsc）。本文对其理化性状、致病机理以及检测方法加以综述。 关键词：朊病毒；羊骚痒病；疯牛病；克—雅氏综合症；致病机理； Abstract：Prion diseases is a family of fatal neurodegenerative disorders in both huma -ns and animals,including scrapie in sheep,Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) in cattle and Creutzfeld-Jakob Disease(CJD) in human.The pathogenic factor of these diseases is thought to be a abnormal isoform protein(PrPSc) of a normal cellular protei -n-PrPC. In this review the present knowledge concerning the physico-chemical featur -es of prion, prion pathogenesis as well as detection method is presented. Keywords: prion; scrapie; BSE; CJD; pathogenesis; 朊病毒,也称为朊粒，是一种只有蛋白质而没有核酸的传染因子。它是动物和人传染性海绵状脑病（Transmissible Spongiform Encephloathy, TSE）的主要致病因子。1982年Prusiner提出“唯蛋白”假说，以后Weismann等人对其逐步完善，并成为目前的主流学说。该假说认为：TSE是哺乳动物细胞中普遍存在的正常细胞PrP(Cellular Isoform of Prion Protein，PrPC)转变为致病性的异常痒病型PrP(Scrapie Isoform Of Prion Protein,PrPSc)所致。PrPSc在感染动物脑内形成不溶性的、抗蛋白酶的积聚物而引起动物发病，1985年英国爆发疯牛病后，朊病毒引起了人们的极大关注。而且随着时间的推移和科研水平的提高，朊病毒蛋白的结构特征、生化特性及致病机理的研究取得了显著进展(刁小龙，2007）。 由朊病毒引起的传染性海绵状脑病有在动物中有羊瘙痒病(scrapie of sheep and goat)、水貂传染性脑病(Transmissible Mink Encephalopathy，TME)、鹿慢性退行性变(Chronic Wasting Disease of Deer，CWD)、牛海绵状脑病(Bovine Spongiform Encephalopathy，BSE)以及猫海绵状脑病(Feline Spongiform Encephalopathy，FSE)等。在人类中的疾病主要有库鲁病(Kuru disease)、克-雅病(Creutzfeld-Jakob Disease，CJD)、格斯特曼综合征(Gretmann-Straussler Syndrome，GSS)、致死性家庭失眠症(Fatal Familial Insomnia，FFI)、克-雅病变种(variant CJD，v-CJD)（侯佩强，2003）。 一、朊病毒的发现及其特性 1 朊病毒的发现 早在200多年以前,英国的牧人就注意到羊的一种致死性疾病，即羊瘙痒病，但病因并不清楚（杨正，2011）。随着技术的发展，这种病越来越被人们所注意。这种为了探究这种致病原的性质，研究人员检测了羊瘙痒病病脑匀浆对动物的致病能力。发现感染因子可以通过滤器，有点象病毒，但与病毒不同，用福尔马林处理不能使之完全失活。1966年，英国放射生物学家Alper发现，这种物质对254nm的紫外线照射不敏感，而对237nm的紫外线敏感。 1972年，由于Prusiner的一位病人死于克雅氏病，促使他开始研究这类疾病。经过10年努力，Prusiner与其同事终于在1982年从仓鼠脑中浓缩了羊搔痒病病原成分。这是一种直径25nm长约100～200nm其浓缩成分的活性可被蛋白酶K，二乙酰焦碳酸、尿素、酚和SDS等破坏，但不能被核酸酶E或紫外线照射破坏。所以Prusiner称之为Prion,意为蛋白性感染颗粒（Proteinaceous infectious particle）。这个成份中只含一种蛋白质，称为朊病毒蛋白（prion protein，PrP），并命名为朊病毒（Virino）。 Prusiner因此获1997年诺贝尔医学和生理学奖。 2 PrPC与PrPSc 与细菌、真菌及病毒等病原体不同，prion是一种不含核酸的蛋白质，普遍存在于人和动物细胞内并由宿主自身基因编码。正常的细胞型构象PrPC没有致病性, 但在一定的条件下可以转化成瘙痒型PrPSc这种异常构象，从而引起传染 性海绵状脑病的发生。PrPC和 PrPSc虽然具有完全相同的一级序列，但因构象上的差异导致生化性质显著不同：PrPC是可溶的单体，以α螺旋为主，易被蛋白水解酶K降解；PrPSc高度不溶，β折叠含量高，极易形成抗蛋白酶K水解的多聚体（林东海，2011）。PrP的构象变化造成了其理化和生化性质的显著变化。 3 PrPSc理化性质及生化特性 3.1 PrPSc独特的理化性质 ⑴ 高压蒸汽灭菌（134℃～138℃）18 分钟不能使其完全灭活。 ⑵ 对紫外线（波长 254nm）照射的抵抗力比一般的病毒高 40～200 倍，但是对 237nm的紫外线敏感（白丽荣，1999）。 ⑶ 对一般的离子辐射和超声波抵抗力很强。 ⑷ 对许多微生物有致死作用的一般化学消毒剂对朊病毒却无法起到坡坏作用，如37℃的20%的福尔马林溶液中可存活28个月。 ⑸ 对多种核酸酶（RNA 酶和 DNA 酶）有抵抗作用，但可以被胰蛋白酶降解。这一点也证明了朊蛋白中不含有核酸。 ⑹ 一些蛋白质变性剂或氨基酸化学修饰剂对其具有灭活或抑制作用，如尿素、SDS 等处理则使其失去活性。 3.2 PrPSc独特的生化特性 ⑴ 不形成包涵体，不含非宿主蛋白，不诱生干扰素，对干扰素也不敏感，不干扰其他病毒诱生干扰素，也不受普通病毒干扰。 ⑵ 不破坏宿主B细胞和T细胞的免疫功能，也不引起宿主的免疫反应。 ⑶ 在电镜下见不到其病原颗粒，但可检测出痒病相关纤维（Sceapre Associate Fibrils，SAF） ⑷ 朊蛋白病毒一旦致病，免疫增强剂和免疫抑制剂均不能改变致病过程。 ⑸ 朊蛋白病毒（PrPSc）在温和的清洁提取物中大量聚合成痒病相关纤维（SAF）或短杆结构，即在非变性去污剂中不溶，而细胞朊蛋白（PrPC）则可以完全溶于其中，只以单体或是二聚体形式存在，故用核磁共振（NMR）和X光谱分析就可以检测到PrPC的三维构象，却不能辨别PrPSc的构象。 ⑹ PrPSc具有相对的抗蛋白酶水解特性，如在用蛋白酶K进行水解时，PrPSc只被水解掉其N-端的67个氨基酸残基，形成PrP27～30，成为其致病的“无敌先锋”。而PrPC则可被完全水解掉，故PrPSc的半衰期特别长，而PrPC的半衰期短（杨建民，2004）。 ⑺ PrPSc和PrPC都依赖于磷酸肌醇磷脂酶结合位点（GPI）附着在细胞表面，经过磷酸肌醇磷脂酶C（PUPLC）酶解后，PrPSc不能从膜上释放，而PrPC则可以。用Trion X-114进行相分离后，PrPC处于水相。而PrPSc则处于Trion X-114 相中。 ⑻ 用特异的抗体与朊蛋白反应，PrPSc有血清反应，而PrPC则没有反应。说明两者的高级结构是不同的。 二、PrPSc的致病机理和转化 1 阮病毒的致病机理 关于朊病毒的致病机理，主要有两种观点。一个是由于PrPC正常功能的缺失，另一个是由于PrPSc的过度增殖而产生神经毒性。除此之外，还有拟病毒假说与联合假说等等。 1.1 PrPC正常功能的缺失 PrPC的编码基因在小鼠中位于2号染色体,在人类位于20号染色体。PrPC在神经元、神经胶质细胞、小胶质细胞、肌细胞、白细胞等多种细胞中表达。关于PrPC生理功能的研究进展较为缓慢，目前发现其可能在神经系统、T细胞信号转导及核酸代谢等方面发挥一定作用（王小凡，2005）。 1.2 PrPSc的神经毒性 PrPSc具有潜在的神经毒性，其中PrP106-126称为神经肽，单独这一段小肽也能使在体外培养的神经细胞发生凋亡。而大量PrPSc在CNS尤其是在脑内的积累可抑制Cu2+与SOD或其它酶的结合，从而使神经细胞的抗氧化作用下降，PrPSc还可抑制星形细胞摄入能诱导其增殖的Glu。此外，细胞内的PrPSc可能还抑制tau调节的微管蛋白的聚合,导致L-型钙通道发生改变，进而使细胞骨架失去稳定性，最终都可使神经细胞发生凋亡并形成空泡状结构，进而使各种信号传导发生紊乱。外在表现为自主运动失调、恐惧、生物钟紊乱等症状（乔俊文，2006）。 1.3 酵母菌朊病毒假说 Cox(1965)发现在某些酵母菌株内存在一种引起终止密码抑制的成分，表现为显性，且不遵守孟德尔遗传规律，故命名为[PSI+]。Lacrout发现某些酿酒酵母菌中存在另外一种非孟德尔成分，与[PSI+]具有相似的遗传特性，该成分被命名为[URE3]。Wickner提出用酵母菌朊病毒假说来解释[PSI+]和[URE3]的遗传行为。认为[PSI+]和[URE3]可能和朊病毒一样，是由细胞内正常成分Sup35和Ure2P经构型改变而来，因为蛋白质的C端失去其正常功能，所以能产生Sup35和Ure2P突变相同的表现型；失去正常结构和功能的Sup35和Ure2P又可与新的Sup35和Ure2P相互作用，诱导他们发生同样的构型改变，从而使[PSI+]和[URE3]表现出显性且不遵守孟德尔遗传规律。因此，将[PSI+]和[URE3]称为酵母菌朊病毒(yeast prion)。与哺乳动物朊病毒不同的是：[PSI+]和[URE3]不在细胞间传播，而是由细胞母代传给子代；也不会导致其存在的细胞发生死亡,而是使其产生新的细胞代谢型。因此,对于哺乳动物和人类，朊病毒是一种致病因子，对于酵母菌，则可视作一类可遗传的代谢表现型决定因子。 1.4 拟病毒假说 Dickinson和Outran首次提出,后由Kimberlin阐述。拟病毒假说即核蛋白论，认为TSEs病原因子是拟病毒,由蛋白质和核酸组成。核酸由宿主酶催化复制,不编码病原因子的蛋白质，但其必需成分与宿主成分(如PrPSc)紧密结合，并受其保护。病原因子蛋白质由宿主基因组编码，并形成核酸的外被，但至今未能证实TSEs病原因子有特异性核酸(Bruce，1997)。 1.5 联合学说 Weissmann认为感染因子是完全朊病毒(holoprion)，它由2种成分组成：一种是分离朊病毒(apoprion)，即PrPSc，由宿主基因组复制，本身就可致病；另一种是协同朊病毒(coprion)，即核酸，它决定毒株的株特异性。这种核酸可能连结于PrPSc上,也存在于正常宿主细胞中。PrPSc单独侵入细胞后，可激活某种细胞核酸,使其呈现协同朊病毒的作用。协同朊病毒借助细胞正常的聚合酶复制，这一过程由PrPSc激发，且可能依赖于PrPSc的存在。这一假说实际上是朊病毒假说和拟病毒假说的综合，使该病原因子的结构理论更趋完善，颇具吸引力,但目前还没有可靠的试验证据(Hornemann，1997)。 2 PrPSc的形成和蓄积 无论PrPSc致病机理是什么，其致病的第一步都是PrPSc的形成过程和蓄积。PrPSc是由PrPC经过构象的转变形成的。关于这一过程目前主要有两种模型来解释： 2.1 重折叠模型 PrPC作为许多动物体的正常代谢的一部分，被不断的合成和降解。但因PrPC结构的随机不稳性，能产生极少数部分未折叠的单体结构，称为PrP*。PrP*是形成PrPSc的中间体。它既能形成两种不同构象的PrP蛋白，即PrPC和PrPSc，也可能和PrPSc形成暂时性的复合物（PrP*／PrPSc）（黄银霞，2006）。然后再转化为两分子的PrPSc。这个过程的发生会使PrPSc呈指数性增长。正常情况下PrP*的浓度很低，PrPSc的形成亦可以忽略不计，但当出现以下三种情况时，PrPSc便会大量地产生和积蓄： ⑴ 在发生传染性朊病毒病时，外源的朊病毒进入细胞，并作为模板促使PrP*转变为PrPSc； ⑵在散发性朊病毒病中，外源的朊病毒参与，可能是由于PrP*积蓄至足以自发产生PrPSc的水平，再通过正反馈环道促使PrP*转变为PrPSc，但这种情况通常很少发生；另一方面，体细胞突变也可使PrPC失稳促使PrP*转变为PrPSc； ⑶在发生遗传朊病毒时，突变的PrPC（△PrPC）作为许多细胞正常代谢的一部分被合成和降解。△PrPC的随机不稳定性比PrPC高，从而产生部分解折叠的单体结构——△PrPC，他和PrP*一样，能重新变为△PrPC被降解，也可转变为△PrPSc，△PrPSc一旦形成即通过正反馈环道促使△PrPC转变为△PrPSc（史怀平，2004）。 2.2 种子模型 低分子量的PrPSc聚合物充当种子。当没有种子时，PrPC和PrPSc单体间发生快速的可逆的构象变化。但PrPC单体构象比PrPSc稳定，因此占主要组分。当种子存在时它可以通过与PrPSc单体形成稳定PrPSc构象，加速PrPC转变为PrPSc，而且此过程是不可逆的（马秀芳，2002）。这一模型能解释朊病毒潜伏期较长的现象。 需要指出的是上述两种模型并不是相互排斥的，在朊病毒增殖过程中有可能是两种模型同时起作用。另外，Yelling等人在后来的研究中，通过实验发现，表达人PrP基因的小鼠不能感染人类的朊病毒，而表达人—鼠嵌合PrP的转基因小鼠则能被感染，据此他们认为仅PrPSc本身还不足以诱导PrPC构象改变，还需要一种辅助因子，他们称之为“蛋白Ｘ”（林海，2002）。Kaneko等人提供了新的证据, 表明在 PrPSc的增殖过程中, 需要 X 蛋白结合到 PrPC的一个不连续表位,包括残基167、171、214 和218四个位点, 否则 PrPSc的转化将受到抑制。“蛋白Ｘ”是由小鼠非PrP基因编码的特异因子，可能是参与催化PrPC分子构象改变的“分子伴侣”，同PrPC和PrPSc形成三元复合物。“蛋白Ｘ”的发现证明在PrPC向PrPSc转变的过程中还需要一些辅助因子参与。 由于 X 蛋白可以通过与PrPC的结合来调控prion的构象转化, 所以许多实验室都在努力寻找X蛋白。目前，已经发现许多能与PrPC发生相互作用的蛋白质比如小鼠STLI、Synapsin、Grb 2、Pint 1、αB-crystalline(Sun G，2005)和tetraspanin-7等。这些潜在的X蛋白是否真正具有转化因子的特性,还需要更多的实验数据支持。值得一提的是，在体内广泛存在的热休克蛋白家族中，Hsp104和Hsp70似乎都能与PrPC发生相互作用, 然而，前者引起prion向抗蛋白酶K水解的状态转化，后者则对类似PrPSc形式的聚集有抑制作用。Prion构象转变过程中或许存在着一种平衡调控或反馈机制。 三、阮病毒的检测方法 1 动物接种试验 动物传递实验是早期判断生物体是否感染朊病毒、研究朊病毒传染性的主要手段，其敏感度较高,但是费时费力。随着检测技术的进步，现在动物实验的许多功能已被更快捷、更准确的方法所代替,但作为生物学方法仍然是研究朊病毒不可缺少的重要环节(Kretzschmar等,1996)。目前常用的朊病毒试验动物包括小鼠、大鼠和仓鼠。 常规试验操作是将无菌组织标本匀浆后连续稀释，每个稀释度从对侧眼角与耳上缘连线的中点处接种于试验动物脑内，接种后24 h内死亡的视为机械性死亡，应该补接，以后正常饲养，每日观察症状，注意出现兴奋、沉郁、共济失调等神经症状的时间，出现上述症状的动物应立即扑杀，取脑组织做组织病理学和免疫学检查，确定其是否感染朊病毒，根据动物发病数和死亡数计算滴度。 2 组织病理学检测方法 朊病毒感染后引起神经元空泡化、神经胶质细胞增生、产生淀粉样蛋白斑块等，同时病变主要集中在大脑皮质部位、海马以及小脑等。在病灶中蛋白纤维呈放射状排列，大脑皮质可见神经纤维节，电镜观察在淀粉样病变区可见纤维样蛋白结构成簇交叉排列，这就是所谓的羊痒病相关纤维(SAF)。 组织病理学检测方法主要是通过检测羊痒病相关纤维(SAF)和神经元空泡化变性来诊断朊病毒的一种方法，也是检测朊病毒的“金标准”方法之一。检查样本在10%福尔马林中固定约3～5d，经常规HE染色，在显微镜下观察其病变的特征表现，这是判定朊病毒的有力依据之一。还可以通过电镜观察脑组织匀浆中的特征性相关纤维的存在。电镜法的基本步骤包括：将被检组织匀浆、差速离心、PK消化、重悬、复染，然后电镜观察，但是电镜法灵敏度较低。 3 免疫学检测方法 3.1 免疫组织化学方法（immunohistochemical） 免疫组织化学检测方法是一种特异性高、敏感性强的诊断朊病毒的方法，其是利用特异性的抗体对组织病理切片进行免疫组织化学染色，检测结果也是确诊朊病毒的重要依据。这种检测技术操作简单，且特异性较高，可以在经甲醛固定、石蜡包埋的组织标本制成的组织切片上直接进行。此法依赖于经蛋白酶K消化以及特异性抗体检测后，观察是否有大小颗粒不等的棕黄色淀粉样物质堆积即PrPSc沉积，基本步骤：组织块预处理，然后依次是蛋白酶K消化以及特异性抗体和酶标二抗孵育，再加底物显色，镜检。 此外有研究结果表明，由于朊病毒体内蓄积速度慢，且甲醛固定、石蜡包埋等处理后，大大削弱了朊病毒的免疫反应性，使用蚁酸对标本进行预处理，大大提高了免疫组化的灵敏度，染色效果也得到改善(Kitamoto等，1987)。也Van Everbroeck等(1999)对各种预处理方法进行试验,优化了一种以恢复被破坏的抗原表位的方法，该法修复被福尔马林破坏的抗原表位效果最好，染色结果也最好。 3.2 免疫印迹法(Western blotting)　 免疫印迹法是目前OIE公认的用于确诊疯牛病的方法之一。该方法具有特异性强、敏感性高、所用材料少的特点。PrPSc具有部分抵抗蛋白酶K消化的能力PrPC又可被蛋白酶K消化，所以免疫印迹法就是利用PrPSc的这一特性对其进行检测的。 免疫印迹的基本步骤：脑组织样品经匀浆处理后，在适当条件下经蛋白酶消化，除去脑组织中PrPC，变性处理后电泳，将脑组织中的不同蛋白质分开，而后通过电转移将蛋白质转移到NC膜上，分别用单克隆抗体和酶标二抗体进行免疫反应，最后用化学发光底物结合底片曝光进行显示。正常动物脑匀浆经蛋白酶K消化后无条带出现，而未消化的正常脑匀浆在底片上可以显示3条条带，分子质量在25～35 ku之间；但朊病毒感染的脑匀浆经蛋白酶K消化后有2条具有蛋白酶K抗性的阳性条带出现，分子质量约25～31ku。 免疫印迹法操作简单，而且可以显示不同的PrPSc类型，还可以从临床前期的淋巴组织器官提取物中检测到PrPSc，从而进行早期的临床诊断，但是操作较困难。该法样本用量较大，离心需要时间长，所以不适合常规的朊病毒检测，更不适合大批量样本的筛查。为了解决这些难题。Lee等(2000)建立了一种检测方法，灵敏度达5～10 pg的PrPSc，可检测出10～20 ng仓鼠脑组织中的朊病毒，并且有较好的重复性。 3.3 组织印迹法(Histoblot)　 组织印迹技术是将灵敏的蛋白检测技术和解剖学组织保存技术结合，检测组织中微量PrPSc的方法。该方法不仅灵敏度高，特异性强,而且大大简化了操作程序，对朊病毒的检测更加快速、简单，已被广泛应用于朊病毒的研究。基本步骤：切取冰冻切片、转入预湿的硝酸纤维素膜上、空气干燥、PK消化、盐酸胍处理、漂洗NC膜，最后进行免疫检测。 但是普通组织印迹的一个明显缺点是必须使用未经固定的组织标本，而大多数常规的病理学标本都是经福尔马林固定的，普通组织印记方法不能对其进行检测。为了解决这一难题，Schulz-Schaeffer(2000)等建立了一种石蜡包埋的组织印迹技术(PET-blot)，该法不仅扩大了组织标本的检测范围，而且保留了组织印迹技术原有的优点，可以检测福尔马林固定、石蜡包埋过的组织标本，在形态学分析方面优于普通组织印迹，但在细胞、亚细胞水平上的微观分析方面不如传统的免疫组化。 3.4斑点印迹法(Dot-Blot)　 斑点印迹法是由Serban等提出，其灵敏度较低，但是操作简单，而且对仪器设备要求低,适合大批量样本的筛查。基本步骤是将组织样本置于冷的裂解缓冲液中匀浆，然后经离心去除不溶性残渣，将上清液与含SDS样本缓冲液等量混合,混合液点样于干燥的NC膜上，经空气干燥、PK消化、硫氰酸胍处理、封闭，最后进行免疫学检测。 3.5 酶联免疫吸附试验法(ELISA)　 酶联免疫吸附试验法具有快速、简便的特点，并且该法可定量，适合大批量样本普查筛选工作。目前用于检测朊病毒的ELISA方法分为间接法和双抗夹心法两种。间接法是先将从各个标本中提取的PrPSc分别包被于酶标板孔中，然后依次加入特异性一抗、酶标二抗，最后加底物显色，酶标仪读板；双抗夹心法是先用特异性抗体包被酶标板，再加入标本提取物，37℃孵育，然后加入特异性一抗、酶标二抗，最后加底物显色，酶标仪读板(Matsui，2011)。 从准确程度上来看，免疫组化和免疫转印的结果与真实情况的符合率都达到100%，而且结果明确、易于判断,相对来说ELISA法稍差，其结果要经过细致分析和数据处理才能作出判断(王志亮等，2001)。 4 蛋白质错误折叠循环扩增 　　蛋白质错误折叠循环扩增(protein misfolding cyclic amplification，PMCA)技术是一种模拟体内PrPC转为PrPSc的体外试验方法，它类似于PCR的体外扩增PrPSc的方法。PMCA技术通过将PrPSc和PrPC混合物在体外试管内进行大量的超声循环和孵育，使得PrPSc通过与正常的PrPC相互作用促使PrPC通过构象改变转变成PrPSc，从而实现自身的扩增和复制(Saborio等，2001)。经过超声波破碎后使PrPSc凝集物破碎形成许多小的PrPSc单位，以这些小单位的PrPSc为“模板”，PrPC为“底物”通过反复循环，使PrPSc获得大量的扩增，从而实现在体外模拟体内PrPC转变成PrPSc复制扩增的过程。该技术的建立有助于研究Prion构象转变的机制，也是目前对Prion疾病进行实验室检测最灵敏的方法。 5 毛细管电泳法 　　毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)是近十几年发展较快的一种高效快速的分离分析技术。毛细管电泳技术是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。由于PrPSc在感染动物的血液中含量非常低，应用一般检测方法灵敏度不足，同时这些方法也只适用于尸检，但CE相对于其它检测方式的优点在于它可以通过检测血液中PrPSc实现活体检测，避免大量屠宰健康动物和疾病传播，从而可以节约大量资金和防止与人类之间的交叉感染。 　　应用较多的是结合免疫荧光技术的毛细管电泳检测法，该方法是根据免疫竞争原理，将无区带毛细管电泳技术与免疫荧光技术相结合，进而检测标本中的微量PrPSc。基本原理是将人工合成的PrPSc特异性肽链标记上荧光，与一定量的特异性抗体、羊脑提取物电泳，当抗体与荧光标记的肽链结合时,迁移率会发生相应变化，从而与游离的标记肽链分离开来，当羊脑提取物中存在微量的PrPSc，PrPSc会与标记肽链竞争性结合抗体，导致结合型肽链与游离型肽链比例发生改变，从而被检测出来。此方法能检测到135pg的PrPSc，有很高的灵敏度，可用于检测朊病毒水平含量较低的组织。 6 双色强荧光目标扫描法 　　双色强荧光目标扫描法可用来检测极微量的朊病毒。基本原理是运用共聚焦双色荧光相关分光镜技术，利用致病性PrPSc在适当条件下自我复制和自发聚集的特点,将重组PrP标记上绿色荧光，PrPSc与正常构象的PrP结合,通过变构复制出大量异常构象的PrP，由于PrPSc在一定条件下可自发聚集,从而使PrPSc周围聚集大量的PrP，使其荧光强度大大增加，同时又加入了能增强试验特异性的标记上红色荧光的特异性单抗,使聚集体又标记上红色荧光。只有同时发出高强度红、绿荧光的颗粒，才能被检测仪器检测到。该方法灵敏度高、特异性好，可用于区别其他的朊病毒。 四、结语 尽管人们在过去的几十年里就朊病毒致病机理方面做了不懈的努力探索，同时在诸多领域取得了一些进展，如朊蛋白的正常生理功能、朊病毒的传播途径及正常朊蛋白向异常朊蛋白空间构象转化机理方面等，然而还有很多的问题没有答案，如PrPSc是朊病中的致病因子还是病理产物，免疫系统为何不能识别体内不同构象的2种朊蛋白，体外试验产生的PrPSc无感染性的机理。对于“唯蛋白”假说仍需要进一步研究与探讨。 在实际应用中，进一步揭示朊病毒疾病的机理，可以使我们更有效地认识朊病毒疾病，进而有效地预防、控制和治疗朊病毒病。迄今为止,还没有建立一种快速、敏感的检测和诊断程序,对于朊病毒病的防制也仅限于预防而非治疗。 参考文献 [1]刁小龙，徐志良，边静静等.朊病毒特性与致病机理研究进展．中国科技论文在线，. 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