液相芯片技术在检验医学和生物医学中的应用WPS.docx

ISSN 100727626 CN 1123870Q综述中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology2007 年 4 月23 (4) :256261 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 液相芯片技术在检验医学和生物医学中的应用杨洋 ,汤华 3(天津医科大学生命科学中心 ,天津 300070)摘要 液相芯片技术是以 100 种不同荧光编码的微球作为探针的载体 ,生物分子间的反应在悬浮 液态体系中进行的一类新的生物芯片技术. 在这个灵活和开放的平台中可进行蛋白质 、核酸等生物大分子的检测. 液相芯片较传统的固相芯片的优势在于检测准确 、信息质量稳定 、可重复性好. 液相 芯片以其易于操作 、高通量 、高灵敏度 、高准确度 、高精密度以及宽的线性测定范围的特点 ,逐渐进 入了临床诊断领域.关键词 液相芯片 ;蛋白质芯片 ;基因芯片 ;生物芯片中图分类号 R331Application of Liquichip in Laboratory Medicine and Biomedical ResearchYANG Yang , TANG Hua 3( Tianjin Life Seicenc Research Center , Tianjin Medical University , Tianjin 300070 , China)Abstract Liquichip is a new type of biochip with 100 different kinds of fluorescent beads as carriers of different probes and the reaction of biomolecules is finished in suspenseful liquid system. It is a flexible technical platform , which is used for protein2analysis , nucleic acid analysis and so on. Compared with traditional biochip , the advantages of liquichip are accuracy , reliable and high reproducibility. It has the characteristics of the easy operation , the high2throughput , the high2sensitivity , the high2accuracy , the high precision and the great dynamic range. It is being applied in the field of clinical diagnose.Key words liquichip ;protein chip ;gene chip ;biochip生物芯片是 20 世纪 90 年代中期以来影响最深 远的重大科技进展之一 ,是融微电子学 、生物学 、物 理学 、化学 、计算机科学为一体的高度交叉的尖端新 技术 ,与微电子芯片一起并称为 20 世纪最伟大的两 大发明. 生物芯片是以某种特定的支持物为载体 ,在 单位面积上高密度地排列大量的生物捕获分子 (核 酸探针 、抗体 、抗原等) ,从而达到一次试验同时检测 多种疾病或分析多种生物成分的目的1 . 生物芯片 在疾病的检测方面具有独特的优势 ,仅需极少量的 样品 ,在极短时间内 ,可以同时检测多种疾病或一种 疾病的多个指标 ,向医务人员提供大量的疾病诊断 信息 ,从而帮助医生在短时间内找到正确的治疗措 施2 . 生物芯片根据其反应体系状态的不同 ,可分为 固相芯片和液相芯片 ,根据检测对象的不同又可分 为基因芯片和蛋白芯片. 传统的固相生物芯片存在 操作繁琐 、信息质量的稳定性和可重复性差的致命 弱点 ,极大地限制了生物芯片在医学诊断领域的临 床应用. 液相芯片技术是 20 世纪 90 年代中期发展起来的被喻为后基因组时代的芯片技术 ,也可称为 灵活的多种被分析物质的检测 (flexible multi2analyte profiling , xMAP) 技术 ,xMAP 技术是集流式技术 、荧 光微球 、激光 、数字信号处理和传统化学技术为一体 的一种新型生物分子高通量检测技术 ,这种技术将 流式检测与芯片技术有机地结合在一起 ,使生物芯 片反应体系由液相2固相反应改变为接近生物系统 内部环境的完全液相反应体系 ,因此也被称为液相 芯片技术. 它的特点是一个灵活的 、开放的技术平 台 ,根据待检测生物分子的不同 ,xMAP 技术可以根 据需要进行相应的构建 ,从而可以对不同的生物分 子进行快速 、廉价 、准确的检测. 2005 年 11 月 ,为了 表彰其对临床诊断技术进步做出的革命性贡献 ,全收稿日期 :2006209225 ,接受日期 :20062122283 联系人 Tel :022225542503 , E2mail :htang2002 yahoo . com Received : September 25 , 2006 ;Accepted :December 28 ,20063 Corresponding author Tel :022225542503 E2mail :htang2002 yahoo . com第 4 期杨 洋等 :液相芯片技术在检验医学和生物医学中的应用257球 科 技 产 业 和 行 业 研 究 的 权 威 机 构 Frost & Sullivan ,授予 xMAP 技术“2005 年度国际临床诊断技 术革新大奖”,标志着 xMAP 技术在国际临床诊断技 术领域的领军地位得到了最具权威的认可. 迄今为 止 ,不到 10 年时间 ,全球已有数百套基于此项技术 的检测平台 ,用于蛋白质免疫学等领域的研究 ,临床 诊断试剂的开发方面也发展相当快 ,自身免疫鉴别 诊断试剂等已通过了美国食品药品管理局 ( FDA) 认 证. 目前 ,全球有两大厂商为用户提供这个检测平 台 ,分别为美国 luminex 公司制造 ,名为 luminex 系列 的产品 ,以及由荷兰控股的 QIAGEN 跨国公司生产 , 名为 BioRobot Liquichip 的产品.1 液相芯片的检测原理液相芯片体系由多种不同的小球体组成 ,目前 这些小球体都是由染有荧光染料的聚苯乙烯构成 , 直径大小为 10 nm1 000 m 之间 ,其中以直径为 516m 的最为常见. 根据荧光染料的比例不同 ,可 将这些微球分为 100 种. 根据这些荧光小球体表面 基团的不同 ,可分为表面带有亲合素的荧光微球 、表 面带有组氨酸标签的荧光微球 、表面带有羧基基团 的荧光微球 ,这些荧光微球通过表面的特定基团可 以交联相应的探针. 荧光微球表面带有羧基基团的 微球在检测分析中最为常用 ,下面主要以表面带有 羧基基团的荧光微球介绍液相芯片的检测原理. 荧 光微球表面的羧基基团经活化后 ,可以与需要交联 的蛋白质探针的氨基基团形成共价键 ,也可以与需要交联的经氨基化修饰的核酸探针形成共价键. 这 样不同荧光编码的微球可以根据需要交联上不同的 探针分子 ,利用这 100 种由不同荧光信号编码的微 球 ,最多可以交联有 100 种不同的探针 ,将这些小球 体悬浮于一个液相体系中 ,与待检分子反应充分后 , 再加入合适的报告分子 ,就构成了一个液相芯片的 反应系统. 液相芯片的检测系统内置两束波长不同 的激光发射器 ,一束激光用来激发荧光微球的自身 荧光物质 ,根据探测到的荧光微球自身发出的荧光 强度来决定探针分子的特异性 (定性) ; 另一束激光 用来激发报告分子所携带的荧光物质 ,通过对报告 分子发出荧光强度的测量 ,对待检生物分子进行定 量或半定量. 利用这个技术系统 ,我们可以对同一个 样品中的多个不同的分子同时进行检测 ,这种检测 技术我们称之为 xMAP 技术.111 大分子蛋白的检测原理大分子蛋白由于具有多个不同的抗原决定表 位 ,因此可以制备出针对这一大分子蛋白的两个不 同抗原决定表位的配对抗体 ,如 Fig. 1 所示 ,检测原 理类似免疫学上的双抗体夹心法. 首先在一种荧光 微球表面交联抗待检蛋白的一种抗体 ,然后加入待 检蛋白分子 ,经过一定时间反应后 ,加入标记有生物 素的另一配对抗体 ,反应一定时间后 ,再加入标记有 藻红蛋白 ( PE) 的链亲合素 ,经过一定时间的反应 , 在 532 nm 波长的激光激发下 , 可检测出报告分子 PE 发出的荧光强度 ,报告分子荧光强度与待检蛋白 含量成正比 ,因此 ,可对待检蛋白进行定量检测.Fig. 1 The way of large molecule protein assay112小分子蛋白的检测原理小分子蛋白由于分子量少 ,蛋白的抗原决定表 位有限 ,甚至只有 1 个 ,不适合类似双抗体夹心法的 检测. 如 Fig. 2 所示 , 可采用免疫竞争法的检测原 理 ,即在一种荧光微球表面交联上这种小分子蛋白 纯品 ,同时加入待检的游离的小分子蛋白和其标记 有生物素的相应抗体 ,这样待检的游离的小分子蛋白就会和交联在微球表面的小分子蛋白纯品竞争结 合抗体 , 经过洗脱后加入 PE 标记的链亲合素 , 在 532 nm 波长的激光的激发下 ,可检测出报告分子发 出的荧光强度 ,荧光强度与待检的小分子蛋白的量 成反 比 , 因 此 , 可 以 对 待 检 小 分 子 蛋 白 进 行 定 量 检测.258中国生物化学与分子生物学报23 卷Fig. 2 The way of small2molecule protein assay113核酸分子的检测原理首先对核酸探针进行氨基化修饰 ,核酸探针分 子上的氨基可与荧光微球表面活化的羧基形成共价 键 ,从而交联在荧光微球表面. 待检核酸分子在通过 聚合酶链反应 ( PCR) 扩增过程中可做适当的生物素 标记. 如 Fig. 3 所示 ,将经 PCR 扩增后的待检核酸分 子与交联在微球表面上的相应探针进行杂交反应 后 ,加入 PE 标记的链亲合素经过一定时间的反应 后 ,可通过 PE 发出的荧光强度对待检核酸分子进 行半定量.Fig. 3 The way of nucleic acid analysis2液相芯片的应用液相芯片技术自问世以来 ,已广泛应用于各种 领域 ,如基因检测 、细胞因子检测 、蛋白质分析 ,还可 应用于药物检测等 ,这极大的推动了临床检测和科 学研究的快速发展.211在激素检测中的应用Bellisario 等3 用液相芯片技术 ,在对新生儿甲 状腺功能的检测中 ,成功的在新生儿干燥的血斑标 本中 ,同时检测并定量了游离甲状腺素 4 ( T4) 和促 甲状腺素 ( TSH) ,并与传统的放免的方法进行了比 较 ,证明了其对判断新生儿甲状腺功能低下的有效 性. 检测灵敏度由 12 个零标准物所测量的平均值加 3 倍标准差决定 ,T4 和 TSH 检测灵敏度分别为 1013 nmolL 和 017 mIUL . 通 过 对 美 国 疾 病 控 制 中 心 (CDC) 提供的新生儿的质控血斑进行测定 ,来确定 方法的准确度和精密度. 测定 T4 的低 、中 、高 、质控品 (真实值实测值) : 分别是 2210 gdl ,5419 gdl 和 7714gdl . 测定 TSH 的高 、中 、低质控品 (真实值 实测值) 分别为 : 2523 mIUL ,4036 mIUL 和 8069mIUL . 由此可见方法的准确度很好. T4 的变异系数 为 614 %10 % , TSH 的变异系数为 412 %516 % , 方法的精密度也很好. 根据放免试剂盒的 T4 正常参 考下限值为 167 nmolL , TSH 的正常参考上限值为 20 mIUL . 在去除所有标本的标识条件下 ,用液相芯 片技术测定了 6 例正常新生儿 , T4 的平均测定值为 320 nmolL (测定值范围为 190407 nmolL) 、标准误8118 nmolL ,TSH 测定浓度小于 10 mIUL . 在对 6 例 诊断为甲状腺功能低下的新生儿测定中 , T4 的平均 值为 89 nmolL (测定值范围为 7998 nmolL) ,标准 误为 715 nmolL ,TSH 平均值为 332 mIUL (测定值范 围为 72499 mIUL) . 作者认为3 ,液相芯片技术在 新生儿甲状腺功能低下的检测中 ,提供了一个灵敏 、 精确和准确的方法 ,用极少量的血清可以同时对样 本中的 T4 和 TSH 进行测定的.212 在病毒抗体检测中的应用Wong 等4 用液相芯片技术检测了人血清和脑 积液中 ,抗西尼罗河病毒 (WN) 外膜糖蛋白 E(rWNV2 E) 的 IgG、IgM 抗 体 , 并 与 传 统 的 酶 联 免 疫 测 定 ( EL ISA) 法进行了比较. 液相芯片较 EL ISA 法检测 , 血清 、脑积液用量少 (血清 100 倍稀释后仅需 30 l 、 脑积液 2 倍稀释需 30l) ,测定用时也大为缩短. 在 抗 原 交 叉 试 验 对 比 中 , 液 相 芯 片 技 术 在 在 检 测 rWNV2E 抗原时 ,同样存在与黄病毒属的其它病毒 如圣路易斯病毒 、日本脑炎病毒 、登革热病毒抗原的 交叉反应问题 ,没有体现出较 EL ISA 法有较高抗交 叉反应的能力. 在特异性方面 ,对 7 例由病毒噬斑抗 体中和试验确诊为阴性的标本的检测中 ,液相芯片 检测结果均为阴性 ,但用 EL ISA 法检测中 ,其中一例 抗 rWNV2E 抗原的 IgM 呈假阳性. 在两种方法相关 性方面 ,通过回顾性实验中对 833 份血清标本 ,分别 用液相芯 片 技 术 和 EL ISA 的 方 法 对 抗 rWNV2E 的第 4 期杨 洋等 :液相芯片技术在检验医学和生物医学中的应用259IgG 和 IgM 分别做了检测. 在对 IgG 的检测中 ,两种 方法阳性结果和阴性检测结果的一致性较好 ,统计 学分析结果为 = 0185. 去除血清标本中的 IgG ,液 相芯片技术对抗 rWNV2E 的 IgM 检出的阳性结果与 EL ISA 法检出的阳性结果做统计学分析 ,= 0125 , 两种方法的一致性不是很好. Wong 等4 认为 ,液相 芯片技术在检测抗 rWNV2E 的 IgM 的敏感性要优于 EL ISA 的方法 ,这是因为 IgM 为一个多价抗体 ,液相 芯片的检测体系是一个悬浮的液相体系 ,较 EL ISA 方法能最大减少抗原抗体结合的空间位阻 ,从而有 效提高其检测的敏感度. 通过对脑脊液中抗 rWNV2E 的 IgM 检测比较中 ,液相芯片技术也同样体现出了 其较 EL ISA 法的优势 ,在 6 例确诊的 WN 患者中 ,液 相芯片的检测结果中 ,其抗 rWNV2E 的 IgM 均为阳 性 ,而 EL ISA 法中只检测出 1 例. 如果利用液相芯片 在 1 份标本中可以检测 100 种指标的优势 ,在检测 中引入黄病毒属的前膜蛋白和非结构蛋白质21 以 及 NS5 抗原 ,可以有效提高其检测的特异性和消除 由于黄病毒属抗原的交叉反应给检测带来的干扰 , 同时也可以实现同时对如圣路易斯病毒 、日本脑炎 病毒登革热病毒的抗体 IgG 和 IgM 的检测5 .213 细胞因子的检测de Jager 等6 基于液相芯片的技术 ,检测了在用 抗原和丝裂原刺激后外周血单核细胞分泌的 15 种 细胞的因子 ,这些外周血单核细胞分别来自于健康 人 、类风湿性关节炎病人 、自身免疫性关节炎病人. 在与常用的 EL ISA 法的方法学比较中 ,对于每一种 因子 、两种方法的相关系数分别在 01750199 范围 之内 ,说明两种方法的相关性较好. 在方法精密度方 面 ,液相芯片技术的批内变异小于 10 % ,批间变异 在 10 %20 %范围内 ,都小于 EL ISA 的方法. 同时液 相芯片的检测结果较被誉为细胞因子检测的“金标 准”EL ISA 法更敏感 、更准确 、检测更省时6 . 与传统 的 EL ISA 法相比 ,液相芯片最大的优势在于可以在 1 个标本中检测多种细胞因子 ,而且标本用量很少. 液相芯片的荧光信号是由 100 个同一类荧光球测量 得到的中位数 ,所以其准确度很高 ,即使降低检测球 的数量 ,这种类似于流式的检测技术也能有效的保 证其准确度7 . 通过实验说明 ,液相芯片是一个强有 力的检测技术 ,它可以对细胞因子做定量检测8 . 利 用这项技术 ,不但能揭示出被激活的淋巴细胞在正 常人和慢性感染的病人中 ,分泌的细胞因子表达谱 差异 ,还可以对正常人与病人或者是患不同疾病的 病人间在细胞水平上的免疫应答加以分析. Kardar等9 通过对接种重组乙肝疫苗免疫后 ,没有免疫应 答的人与接种疫苗后产生抗体的人对比研究中发 现 ,没有免疫应答的人其辅助型 T 淋巴细胞21 ( Th2 1) 、辅助型 T 淋巴细胞22 ( Th22) 的应答性显著降低. 在对接受治疗的关节炎患者组与对照组的细胞因子 水平比较中 ,发现经过治疗可以增加总的细胞因子 的表达量10 . 此外 ,在对过敏性病人的研究中发现 经免疫治疗后 ,会发生对特异性过敏原的免疫应答 由 Th21 向 Th22 表型的转变11 .214 基因的检测液相芯片也可以应用于基因检测领域 , Bortolin 等12 用液相芯片的技术对与血栓形成相关的基因 多态性进行了检测 ,并与传统单链构象多态性聚合 酶链反应 ( PCR2SSCP) 的方法进行了比较. 以基因测 序作为检测结果比较的金标准 ,结果表明 ,液相芯片 的方法较 PCR2SSCP 的方法对基因多态性的检测更 为准确. 作者在 132 个病人中 ,对与血栓形成相关的 6 种基因 :编码凝血因子 5 (factor ) 的基因 、编码凝 血因子 2 (factor ) 的基因 、编码凝血因子 13 (factor ) 的 基 因 、编 码 亚 甲 基 四 氢 叶 酸 还 原 酶 677 (MTHFR 677) 的基因 、编码亚甲基四氢叶酸还原酶1298 (MTHFR1298) 的基因以及编码组织因子抑制因 子 ( TFPI) 的基因 ,进行了基因多态性的检测. 检测的 主要原理为 :用特异性引物对 6 种基因进行 PCR 扩 增 ,之后再用针对突变点设计的特异性引物 (引物前 面连接有一段特异的寡聚核苷酸称为 Tag) 进行再 次扩增. 在第二次扩增时 ,加入标记有生物素的脱氧 胞苷三磷酸 ( dCTP) ,这样如果有突变点的存在 ,扩 增出来的产物就标记有生物素. 液相芯片的 6 种荧 光微球分别交联与相应 Tag 互补的寡聚核苷酸序 列 ,这样在液相的反应体系中 ,所有特异扩增出的产 物可以与微球通过互补的序列而结合在一起 ,加入 标记有 PE 的链亲和素 ,就可以通过产生的荧光信 号来确定基因多态性. 作者认为12 ,由于 Tag 为通用 的寡聚核苷酸序列 ,因此用这种方法在检测其它基 因的多态性方面有很强 的 拓 展 性. 同 时 作 者 也 强 调12 ,由于一些非互补的核苷酸序列有一定的错配 机率 ,因此会有一些非特异信号的产生 ,会对实验造 成一定的干扰 ,但非特异信号的产生只占总信号的 317 %. 液相芯片的技术在致病基因的临床诊断和检 测上有很大的应用价值 ,与传统的对单个核苷酸多 态性 (SNP) 检测方法相比 ,液相芯片的技术不但准 确 、经济 ,而且高通量13 17 . Lu 等18 用液相芯片和 固相 芯 片 的 技 术 分 别 做 了 不 同 分 类 癌 症 的 微 小260中国生物化学与分子生物学报23 卷RNA (microRNA) 的表达谱的研究. 结果表明 ,液相芯 片得出的结果在准确性 、抗交叉反应性 、探测的线性 范围方面要明显优于固相芯片得出的结果 ,而且与 RNA 免疫印迹 (Northern blot) 的结果一致. 从理论上 讲 ,液相芯片中核酸的杂交反应较固相芯片更接近 真实的反应环境 ,因此 ,可以有效提高反应的特异性 并且提高反应的效率 ,而且液相芯片较固相芯片更 经济 、使用更具有灵活性18 .3 液相芯片的优点及不足液相芯片较传统的固相生物芯片相比主要优点 在于 ,检测准确度高 、信息质量稳定 、检测结果可重 复性好 、检测用时短 、操作简便 ,缺点主要在于相对 固相芯片检测通量低.与现有用于临床诊断的化学发光 、电化学化光 法及 EL ISA 法相比 ,优点主要在于以下几个方面 :1) 高通量 ,一次可以同时检测多种 (100 种) 生理病理 指标. 这与传统方法的逐个检测相比是一个质的飞 跃. 2) 高敏感 ,液相芯片的灵敏度是常规的 EL ISA 方 法的灵敏度 10100 倍19 . 与电化学发光及化学发 光的方法相比 ,敏感性等同或略高. 3) 线性范围宽 , 检测的线性范围比常规的 EL ISA 方法高 10 倍以上 , 可以达到 35 个数量级 ,检测浓度范围可以在 pg g 级19 . 4) 反应快速快 ,因为杂交或免疫反应在悬 浮的液相中进行 ,有利于生物分子间的相互作用 ,反 应时间可缩短到十几分钟3 ,19 . 5) 重复性好3 ,19 ,液 态芯片杂交发生在准均相的液体环境中 ,在反应中 有利于生物大分子保持其正确空间构象 ,使检测结 果稳定. 同时在对每个指标的检测中 ,在同一个反应 体系中有其相对应的1 0005 000颗相同的微球. 检 测时 ,抽取其中的 100500 颗读数 ,最终的数据是 取其所有值的中位数 ,这样可以把误差减到最小 ,从 而使检测结果重复性好. 6) 检测血清用量少 ,液相芯 片的血清用量较 EL ISA 法 、化学发光法 、电化学发光 法要少得多.液相芯片的主要缺点是检测人血清中的特异性 抗体时 ,检测的背景信号过高 , 给实验造成严重干 扰. 这是因为血清含有的抗体可以直接结合在微球 上 ,这种效应类似于在免疫测定由异嗜性抗体导致 的干扰20 . 在不同人的血清中这种非特异的结合的 比例是不同的 ,但是高达 80 %的人血清中含有异嗜 性抗 体. 血 清 预 先 与 聚 乙 烯 醇 、聚 乙 烯 吡 咯 酮 、 proprietary 试剂培育 ,可以有效的减少非特异性的背 景信号的产生 ,但是 proprietary 试剂在减少背景信号的同时也减少特异性信号的产生21 . 应用 luminex的 SeroMap 微球仅能部分的解决这些问题21 .4液相芯片的应用前景液相芯片是个灵活的技术平台 ,研究者可以根 据需要开发许多检测项目 ,为科研工作者拓展了极 大的研究空间 ,因此在生命科学研究的诸多领域有 着广泛的应用前景 :临床诊断如肿瘤标志物 、内分泌 激素 、遗传性疾病的基因诊断 、组织配型的基因检 测 、病原菌感染的检测 ; 基础研究如免疫学分析 、受 体2配体分析 、基因组学研究 、蛋白质组学研究 、酶与 底物相互作用的研究等 ; 新药开发如 SNP 检测 、识 别蛋白激酶的作用底物等 ,为药物基因组学研究和 作用机制提供有力的技术支持. 此外 ,液态芯片技术 还可用于司法鉴定 、食品卫生监督 、生物武器防范等 领域.参考文献 ( References)1 Livingston A D ,Campbell C J ,Wagner E K ,et al . 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