医学细胞生物学第三章研究方法.ppt

第三章细胞生物学的研究方法 学习目的与要求 掌握细胞生物学基本研究方法的原理和应用 熟悉细胞生物学基本研究方法的技术特点 了解细胞生物学研究方法的进展 第一节显微镜技术 光学显微镜 观察显微结构 lightmicroscope 显微镜电子显微镜 观察亚显微结构 electronmicroscope 一 光学显微镜 一 普通光学显微镜 以日光或灯光为光源分辨率 在25cm的明视距离处 能分辨被检物体细微结构最小间隔的能力 常用极限分辨率来表示 细胞显微结构的大小比较动物细胞 细菌 线粒体 流感病毒 核糖体 绿色荧光蛋白 胸腺嘧啶 分辨率 极限分辨率 的计算公式横向分辨率Rx y 0 61 n sin 纵深分辨率Rz 2 n sin 2n 介质的折射率 空气1 0 油1 5 视锥半顶角 sin 最大值为1 光的波长R实际上是能分辨的最小距离D分辨力 1 R 第二章细胞生物学的研究方法 第一节显微镜技术 光学显微镜 lightmicroscope 显微结构电子显微镜 electronmicroscope 亚显微结构纳米显微 分子结构及分子间相互作用 不同显微结构的尺寸 虚线为光学显微镜分辨极限 一 光学显微镜 一 普通光学显微镜 以日光或灯光为光源1 分辨率 resolution R 显微镜或人眼在25cm的明视距离处 能分辨被检物体微细结构最小间隔的能力 分辨率 R 常用极限分辨率来表示 即能分辨的最小间隔的距离横向分辨率 Rx y 0 61 n sin 纵深分辨率 Rz 2 n sin 2镜口率NA nsin 波长 白光500nmn 介质的折射率 空气为1 油为1 5 视锥半顶角 组织切片制备过程 固定 fixation 使大分子交联 变性 防止结构移位或信息丢失 常用的固定剂 戊二醛 甲醛包埋 embedding 使组织形成硬块 便于切片 常用的包埋剂 石蜡 树脂切片 section 切片厚度为1 10 m 染色 staining 增大反差 二 荧光显微原理 荧光物质在短波光 紫外线 蓝光 的激发下发生光能转换 发出长波光线 可见光 结构 增加短波光线激发装置 汞灯 氩灯 特点 成像反差强 检测灵敏度高 应用 荧光染色 荧标记和自发荧光物质的定位和定量观测实时观察活细胞内分子的动态变化 三 共聚焦激光扫描显微镜 原理 针孔激光作为光源物镜和聚光镜共聚焦 只有从标本焦面发出的光线聚焦成像 焦面以外的漫射光不参加成像 逐点扫描 对一个光切面逐点扫描特点 只摄取一个光切面的图像 图像清晰 可利用电脑对图像进行三维重构 获得立体图像应用 对细胞内物质进行精确定位和动态观察 共聚焦激光显微镜工作原理示意图 共聚焦激光显微镜下的血管内皮细胞微丝的分布 共聚焦激光显微镜获得被检物体三维结构的原理及呈现的三维图像 四 相差显微镜1 原理 利用光的衍射和干涉 将被检物体不同密度部位产生的相位差放大 转换成振幅差2 应用 活体细胞的观察 相差显微镜观察体外培养的贴壁细胞 原理 散射光成像特点 分辨率不高应用 活细胞内的细胞核 线粒体 液体介质中的细菌和真菌等的观察 四 暗视野显微镜 暗视野显微镜工作原理 二 电子显微镜原理 以电子束代替光线 电磁场代替透镜特点 分辨力强 可达0 1nm物体的亲电子差异反映物体的颜色和密度差异应用 用于观察亚微结构或超微结构 结构 电子枪 电子加速器 磁场透镜 载物台 显示屏等分类 透射电镜 扫描电镜 隧道扫描电镜 光学显微镜与透射电子显微镜的比较 二 扫描电子显微镜 scanningelectronmicroscope SEM 原理 通过电子束照射在标本后产生的二次电子成像 二次电子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关 应用 可以直接观察标本表面的三维形态 扫描电镜的工作原理 二 细胞化学法技术 一 细胞化学 用特异的方法使待测化学成分着色或显示 一 细胞特殊染色1 核酸 普通染料 Feulgen染色 甲基绿 派洛宁染色荧光染色 吖啶橙 溴化乙啶2 蛋白质 特殊染料 双偶氮反应 粘洋红 粘苏木素 3 糖 高碘酸雪夫氏试剂 二 酶细胞化学技术 特殊的生色底物金属盐沉淀 胶体金颗粒色素形成 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 嗜锇着色法 电镜 三 免疫细胞化学 抗原 抗体反应免疫组织化学 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 免疫荧光 三 原位杂交 InSituHybridization ISH 用不同颜色的荧光标记的DNA探针 probe 在细胞核或染色体上杂交显色 鉴别特异基因序列 广泛应用于基因诊断和定位 染色体端粒检测基因定位及诊断 二 放射自显影同位素标记 使乳胶 胶片 感光 显影成像三 化学发光辣根过氧化物酶标记 鲁米诺 lumino 发光 乳胶 胶片 感光成像 四 细胞的分离和分析技术 一 离心分离技术 利用离心力和物质沉降系数的差异进行分离沉降系数S表示沉降速率1 差速离心法 利用细胞内不同组分的沉降系数差异 由高到低逐级分离2 速度沉降法 利用不同浓度的介质溶液所形成的密度梯度来分离沉降系数不同的物质 不连续密度梯度 蔗糖 Ficoll 甘油3 平衡沉降法 制备顶部到底部高浓度差的介质溶液 分离不同密度的颗粒 连续密度梯度溶液 蔗糖 氯化铯 CsCl 差速离心的原理 速度沉降 A 和平衡沉降 B 离心的比较 速度沉降分离溶酶体 线粒体和微体 等密度离心分离DNA RNA和蛋白质 第二节细胞培养与细胞融合 一 细胞培养概念 活体组织分离或建系的细胞在体外一定条件下培养 使之继续生长繁殖的技术方法 2 条件 培养基 温度 PH值 湿度 渗透压 O23 分类 原代培养 传代培养 原代培养 primaryculture 直接从机体取下细胞 组织和器官后立即进行培养 传代培养 secondaryculture 将适应体外生长的原代培养细胞转移并扩大培养细胞系 cellline 同一组织来源细胞在传代培养成功后形成的转化 永生 细胞 细胞株 cellstrain 由单个转化细胞增殖克隆化后形成的具有稳定形态和生化标记的细胞 一般哺乳动物细胞在体外传代次数为30 50代转化细胞和恶性肿瘤细胞可以无限繁殖 贴壁生长体外培养的细胞贴附在瓶壁上生长 称为细胞贴壁 呈单层生长 所以此法又叫单层细胞培养 单层培养的细胞保持接触抑制 contactinhibition 的特性 悬浮生长细胞在培养过程中不贴壁 一直悬浮在培养液中生长 如淋巴细胞 分类 A 异核体 不同来源的细胞核融合B 同核体 相同来源的细胞核融合C 合核体 异源染色体合并在一起 杂种细胞 第三节分子生物技术 一 分子分离与鉴定技术凝胶层析分离 凝胶过滤 离子交换 亲和层析凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶 PAGE 电泳 二 核酸分子杂交技术利用DNA变性 复性原理 用一条已知序列DNA链 探针 probe 与目的DNA互补杂交 检测目的基因是否存在的技术 核酸杂交的原理 southernbloting操作步骤 southernbloting结果 基因芯片技术 DNAmicroarraysorDNAchips 概念 基因芯片技术是DNA杂交探针与半导体工业技术相结合的产物 将许多探针做成芯片 固定于支持物上 然后与待测DNA样品进行杂交 应用于大规模筛查基因突变或表达 GenescreeningusingaDNAmicroarray 分子杂交的种类 Southern杂交用单链核酸探针检测目的DNA序列的技术 英国科学家Southern发明 Northern杂交用单链核酸探针检测RNA的技术 与DNA检测相对应 人为命名 Western杂交用标记抗体检测蛋白质的技术 与核酸检测技术相似 人为命名 三 PCR技术原理 1 变性 在95 高温下模板双链DNA解开成单链DNA 2 退火 将反应系统降至55 使引物能与模板单链DNA的特定部位配对结合 3 链延伸 在72 以单链为模板 在引物的3 末端以互补原则合成新链 四 基因重组技术体外对DNA进行重组 克隆 涉及到的工具酶有 限制性内切酶 识别特定的碱基序列 并能在DNA链中间切断磷酸二酯键的酶 已发现有200多种酶切后 粘性末端与平头末端两种类型 粘性末端与平头末端 EcoRI