有机法提取DNA的原理.doc

DNA 提取中各种实验试剂作用原理 1、STE是Tris-Hcl、EDTA、Nacl的混合液。其总体作用是为DNA提供保护环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。Tris.HCl提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态。EDTA：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。NaCl，有利于DNA的溶解。2、SDS的作用：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodiumdodecylsulfate）使DNA与蛋白质分离，在高温（5565）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，3、苯酚的作用：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。Tris酚的颜色，一般为黄色。如果变成粉红色，说明被氧化，不能再用。4、氯仿的作用克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）5、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。6、用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。7为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2产生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定。8、STE是Tris-Hcl、EDTA、Nacl的混合液。其总体作用是为DNA提供保护环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。Tris.HCl提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态。EDTA：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。NaCl，有利于DNA的溶解。9、SDS的作用：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodiumdodecylsulfate）使DNA与蛋白质分离，在高温（5565）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，10、苯酚的作用：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。Tris酚的颜色，一般为黄色。如果变成粉红色，说明被氧化，不能再用。11、氯仿的作用克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）5、异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。12、用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。Tris中文品名:三羟甲基氨基甲烷;氨基丁三醇;缓血酸胺Tris结构式英文品名:Tris;Tris(Hydroxymethyl)aminomethane英文别名:2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediolTHAM;Trisbase;Trometamol通用CAS:77-86-1产品纯度:100%(USP药典级)/99.9%(实验室技术级)产品级别:USP药典级,符合USP/EP/cGMP对药物赋形剂的要求分子式:NH2C(CH2OH)3分子量:121.14使用用途:生物制药,体外诊断,个人护理及化妆品原料等保存温度:常温密封避光保存TRIS是一种最常用的生物缓冲液，常配成PH值为6.8，7.4，8.0，8.8。其PH值随温度变化很大。一般来说，温度每升高一度，PH值下降0.03。1MTRIS-HCl6.8和1.5MTRIS-HCl8.8是SDS-PAGE最常用的试剂。而由TRIS配成的TAE，TBE等是DNA电泳最常用的试剂，TE（PH8.0）主要用于溶解DNA。TE为Tris加EDTA合称。缓冲特性：Tris为弱碱，在室温（25）下，它的pKa为8.1；根据缓冲理论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于Tris的pKa的影响。衍生缓冲液：由于Tris缓冲液为弱碱性溶液，DNA在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶解性。人们常常在Tris盐酸缓冲液中加入EDTA制成“TE缓冲液”，TE缓冲液被用于DNA的稳定和储存。如果将调节pH值的酸溶液换成乙酸，则获得“TAE缓冲液”（Tris/Acetate/EDTA），而换成硼酸则获得“TBE缓冲液”（Tris/Borate/EDTA）。这两种缓冲液通常用于核酸电泳实验中。制备：Tris可以由两步反应生成：先由硝基甲烷生成中间体三羟甲基硝基甲烷（(HOCH2)3CNO2），然后再由该中间体还原得到Tris。用途：Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途