高三生物酶工程二轮复习资料课件.ppt

酶工程 学习目的 初步掌握酶的发酵生产和分离纯化的大致流程以及酶制剂的保存方法 对酶的固定化 酶的修饰改造和主要的酶的反应器类型有一定的认识 了解生物传感器及酶对现代人类生活的影响 关于酶和酶工程enzyme 酶是由生物的活细胞所产生的 具有催化活性和高度特异性的蛋白质 酶学是在生物化学基础上发展起来的一个重要分支 是现代生物工程的重要内容 与生化一样 近百年来获得重要发展 形成两个主要方向 酶基础研究主要成果 酶的结构及其与功能的关系酶的作用特点与机制酶促反应动力学 酶工程简介酶工程 enzymeengineering 是生物工程的主要内容之一 是随着酶学研究迅速发展 特别是酶的应用推广 酶学和工程学相互渗透结合 发展而成的一门新的技术科学 第一届国际酶工程会议于1971年在美国召开 当时提出的酶工程的主要内容是 酶的生产 分离纯化 酶的固定化 酶及固定化酶的反应器 酶与固定化酶的应用 从现代观点来看 酶工程主要有以下几个方面的研究成果 1 酶制剂的分离 提纯 大批量生产及新酶的开发 2 酶生产中的基因工程技术的应用 3 酶与细胞的固定化 4 酶分子的改造与化学修饰 以及酶结构与功能的研究 5 酶的应用性开发 6 酶反应器的研究 包括反应检测 7 酶抑制剂 激活剂开发及应用研究 8 模拟酶 合成酶及酶分子的人工设计 合成的研究 酶与酶工程研究的重要意义 在生物体内 许多复杂化学变化都按一定途径 根据生命活动需要进行得极为顺利 相互联系又相互制约 迅速而又有条不紊 这种使化学变化变得容易发生和迅速进行的根本原因 就是生物体内普遍存在着生物催化剂 酶 可以说离开了酶在生物体内的催化作用 生命也就停止了 研究酶的理化性质及其作用原理 对于阐明生命现象本质也具有十分重要的意义 特别是现代生物科学发展已经日益深入到分子水平 日益深入到以生物大分子结构与功能关系来说明生命现象的本质和规律 从酶分子水平去探讨酶与生命活动 与代谢调节 与疾病 生长发育等等的关系 对阐明生命活动的本质和规律 无疑具有十分重要的意义 一般认为应用研究促进了酶工程的形成 1808年 罗门等利用胰酶制皮革 1917年 法国用枯草芽孢杆菌生产淀粉酶作纺织工业上的褪浆剂 酶工程的发展历史应从第二次世界大战后算起 1949年 日本采用深层培养法生产 淀粉酶 使酶制剂生产进入工业化阶段 酶工程发展简史 1959年 由于采用了葡萄糖淀粉酶催化淀粉生产葡萄糖新工艺研究成功 彻底废除了原来葡萄糖生产中需要高温高压的酸水解工艺 并使淀粉得糖率从80 上升为100 致使日本在1960年葡萄糖产量猛增10倍 这项新工艺改革成功 大大地促进了酶在工业上应用的前景 1969年 日本人千钿一郎首先应用固定化氨基酰化酶拆分dl 氨基酸获得成功 20世纪70年代大规模开展了固定化细胞与辅酶共固定 增殖细胞固定 动植物细胞固定等研究 尽管目前业已发现和鉴定的酶约有8000多种 但大规模生产和应用的商品酶只有数十种 自然酶在工业应用上受到限制的原因主要有 大多数酶脱离其生理环境后极不稳定 而酶在生产和应用过程中的条件往往与其生理环境相去甚远 酶的分离纯化工艺复杂 酶制剂成本较高 根据研究和解决上述问题的手段不同 将酶工程分为化学酶工程和生物酶工程 化学酶工程是指天然酶 化学修饰酶 固定化酶及化学人工酶的研究和应用 生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物 主要包括3个方面 用基因工程技术大量生产酶 克隆酶 修饰酶基因产生遗传修饰酶 突变酶 设计新的酶基因 合成自然界不曾有的新酶 5 1酶的发酵生产 发展微生物作为酶生产的来源的主要原因 微生物生长繁殖快 生活周期短 产量高 单位干重产物的酶比活很高 微生物培养方法简单 所用的原料大都为农副产品 来源丰富 价格低廉 机械化程度高 经济效益高 微生物菌株种类繁多 酶的产品齐全 微生物有较强的适应性和应变能力 可以通过适应 诱导 诱变及基因工程等方法培育出新的产酶量高的菌种 酶发酵生产常用的微生物 枯草芽孢杆菌 bacillussubtilis 生产 淀粉酶 蛋白酶 青霉素酶 溶菌酶 5 磷酸二酯酶 大肠杆菌 escherichiacali 生产天门冬酰氨酶 青霉素酰化酶 酰基转移酶 谷氨酸脱羧酶 多核苷酸化酶 半乳糖苷酶 黑曲霉 aspergillusniger 淀粉酶 蛋白酶 果胶酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 油柑酶和橙皮苷酶 脂肪酶 米曲霉 aspergillusoryzae 果胶酶葡萄糖异构酶 酰化氨基酸水解酶 青霉 penicillium 葡萄糖氧化酶 蛋白酶 青霉素v酰化酶 木霉 trichodema 纤维素酶 根霉 rhizopus 淀粉糖化酶 脂肪酶 果胶酶 半乳糖苷酶 毛霉 mucor 蛋白酶 淀粉糖化酶 脂肪酶 果胶酶 凝乳酶 链霉菌 streptomyces 葡萄糖异构酶 溶菌酶 抗胰酶 青霉素v酰化酶 角蛋白酶 碱性蛋白酶 半乳糖苷酶 脂肪酶 纤维素酶 淀粉酶 啤洒酵母 sacharomycescerevisiae 凝血激酶 尿激酶 假丝酵母 candila 5 1 1优良产酶菌种的筛选一个优良的产酶菌种应具备的要求 繁殖快 产酶量高 有利于缩短生产周期 能在便宜的底物上生长良好 产酶性能稳定 菌种不易退化 不易受噬菌体侵染 产生的酶容易分离纯化 不是致病菌及产生有毒物质的微生物 生产菌的获得 购买或索要 采样 分离 筛选 诱变 采样 去富含该酶作用底物的场所采样 或去与酶活性最适条件相仿的环境采样分离 平板划线法 直接稀释法筛选 初筛 复筛诱变 5 1 2基因工程菌 细胞 的构建一个理想的宿主应具备的特性 所希望的酶占细胞总蛋白量的比例要高 能以活性形式分泌 菌体容易大规模培养 生长物特殊要求 且能利用廉价的原料 载体与宿主相容 克隆酶基因的载体能在宿主中稳定维持 宿主的蛋白酶尽可能的少 产生的外源酶不会被迅速降解 宿主菌对人安全 不分泌毒素 构建工程菌分为四步 目的基因片断的产生和分离 目的基因片断共价连接到载体上 即体外重组 体外重组的杂合分子转入合适的宿主 筛选和检测 基因工程基本流程图 分离 酶切 外源基因 供体细胞 载体分子 拼接 基因工程基本流程图 续 dna重组分子 受体细胞 转化 扩增 基因工程基本流程图 续2 鉴定表达 蛋白表达产物 培养纯化 5 1 3微生物酶的发酵生产5 1 3 1培养基碳源 氮源 无机盐类 生长因子 培养基的ph5 1 3 2酶的发酵生产方式固体发酵和液体深层发酵注意控制条件 温度 通气和搅拌 ph的控制 5 1 3 3提高酶产量的措施 添加诱导物 诱导酶 对于诱导酶的发酵生产 添加适量诱导物可使酶产量显著提高 许多工业用酶都属诱导酶 诱导物 原理是加入效应物与阻遏蛋白结合 阻止其与操纵基因结合 使结构基因得以表达 实际工作中 关键是选择一个恰当的诱导物 确定诱导浓度及诱导时间 包括酶的作用底物 酶的反应产物和酶的底物类似物 降低阻遏浓度引起阻遏的原因有两种 1 尾产物阻遏 可去除尾产物或使其尽量少形成 如添加尾产物类似物或抑制剂 采用营养缺陷型菌株并限制其生长必需因子的供应 2 分解代谢产物阻遏 a 尽量不要采用葡萄糖等易被利用的碳源 b 流加 表面活性剂促进分泌到胞外细胞内酶含量提高到一定程度 会被胞内蛋白酶分解 加入表面活性剂之类促进分泌剂 可使胞内酶未被分解即被释放到胞外 因为表面活性剂有助于改善细胞通透性 因而也可打破细胞内酶合成的 反馈平衡 常用 tween 80 tritonx 100等 添加产酶促进剂 5 2酶的分离纯化指把酶从组织 细胞内或细胞外液中提取出来并使之达到与使用目的相适应的纯度 遵循 根据使用目的 工业用 分析用 医用 质量要求 制备方法的经济性 还应符合步骤短 收率高 成本低的要求 提取时注意温度 ph 盐浓度 搅拌和微生物污染 5 2 1酶制剂的制备破碎细胞 组织匀浆机 机械破碎法 酶法 化学试剂法 物理破碎法 溶剂抽提 大多数酶蛋白用稀酸 稀碱和稀盐溶液抽提 离心分离 工业一般使用板框压滤机 浓缩 吸附 沉淀 凝胶 真空薄膜 干燥 真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥等 5 2 2酶的纯化与精制 5 2 2 1根据酶分子大小和形状的分离方法 1 离心分离 2 凝胶过滤 3 透析与超滤5 2 2 2根据酶分子电荷性质的分离方法 1 离子交换层析 是利用离子交换剂的可解离基团对各种离子的亲和力不同 而使不同物质分离的方法 2 层析聚焦 3 电泳分离 4 等电聚焦电泳5 2 2 3根据酶分子专一性结合的分离方法 1 亲和层析 是利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术 2 染料配体亲和层析 3 共价层析5 2 2 4根据分配系数的分离方法双水相萃取分离 5 2 3酶的纯度与酶活力 酶活力 催化反应的能力 表示样品中酶的浓度 u ml酶液 总活力 整个样品中的全部酶活力 即酶活力 u ml酶液 酶液总体积 ml 回收率 提纯前与提纯后酶的总活力之比 比活力 单位蛋白质 蛋白质或蛋白氮 所含有的酶活力 提纯倍数 提纯前后比活力之比 5 2 4酶制剂的保存 注意方面 温度 缓冲液 氧化 还原 蛋白质的浓度及纯度 5 3酶分子的改造 酶分子的修饰是指通过对酶蛋白主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造 改造的目的在于改变酶的一些性质 创造出天然酶不具备的某些优良性状 扩大酶的应用以达到较高的经济效益 注意方面 1 修饰剂的要求 2 酶性质的了解 3 反应条件的选择 5 3 2酶的蛋白质工程 杂交酶 杂交酶是指利用基因工程将来自两种或两种以上酶的不同结构片段构建成的新酶 抗体酶 依据对酶分子催化反应机制的理解 结合免疫球蛋白的分子识别性质 制备出具有高度底物专一性及特殊催化活力的新型催化抗体 即抗体酶 模拟酶 是一类利用有机化学方法合成的比天然酶简单的非蛋白质分子 5 4生物催化剂的固定化 将酶与水不溶性的载体结合 制备固定化酶的过程称为酶的固定化 固定化酶的原则 1 必须注意维持酶的催化活性和专一性 2 酶与载体必须紧密结合 便于回收贮藏和反复使用 3 载体要有相当的机械强度 不可以因为机械搅拌而破碎或脱落 4 固定化酶要有最小的空间位阻 尽可能不妨碍酶与底物的接近 可以保证提高产量 5 固定化酶要有最大稳定性 载体不可与底物 产物发生反应6 固定化酶要廉价 以便于工业生产 5 4 1酶的固定化的方法5 4 1 1载体结合法 1 物理吸附法物理吸附法是通过氢键 疏水键和 电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法 常用的载体有 高岭土 皂土 硅胶 氧化铝 磷酸钙胶 微空玻璃等无机吸附剂 纤维素 胶原 塞珞玢以及火棉胶等有机吸附剂 2 离子交换吸附法离子交换吸附法是指在适宜的ph和离子强度条件下 利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法 最常用的交换剂有cm 纤维素 deae 纤维素 deae 葡聚糖凝胶等 其他离子交换剂还有各种合成的树脂如amberlitexe 97 dowex 50等 离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂 3 螯合法 4 共价结合法共价偶联法是目前研究中最为活跃的方法 它的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键 因而将酶固定在支持物上 5 4 1 2共价交联法基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三向的交联网状结构 交联试剂是戊二醛和双耦联苯胺 2 2 二磺酸 5 4 1 3包埋法 1 聚合物包埋法 常用材料有聚丙烯酰胺 k 角叉莱胶 卡拉胶 胶原和明胶 海藻酸钠 聚乙烯醇 2 微囊法主要将酶封装在胶囊 脂质体和中空纤维中 胶囊和脂质体主要用于医学治疗 中空纤维主要适于工业使用 3 脂质体包埋 吸附法 包埋法 共价交联法 共价藕联法 5 4 2细胞的固定化方法1 包埋法海藻酸钙凝胶包埋法琼脂凝胶包埋法角叉菜胶包埋法明胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法光交联树脂包埋法2 吸附法 四种固定化酶制备方法的特点小结 制法 特性 5 4 3固定化酶 细胞 的性质1 酶活力的变化2 酶稳定性的提高3 最适ph值的变化4 最适温度的变化5 动力学常数的变化5 4 4固定化酶的指标1 相对酶活力2 酶的活力回收率3 固定化酶的半衰期 酶反应器 5 5 1酶反应器的基本类型 5 5 1 1搅拌罐型反应器5 5 1 2固定床型反应器5 5 1 3流化床型反应器5 5 1 4膜式反应器 5 5 2酶反应器的设计原则 为了设计反应器以及决定反应操作条件 理论上必须了解下列事项 1 底物的酶促反应动力学以及温度 压力 ph等操作参数对此特性的影响 2 反应器的型式和反应器内流体流动状态及传热性 3 需要的生产量及生产工艺流程 酶反应器的性能评价 1 酶反应器生产强度 酶反应器的生产强度表示每小时每升反应体积所生产的产品的克数 2 产品转化率及酶的催化率 产品转化率是指每克底物中有多少克转化为产物 3 产物浓度及底物停留时 产物浓度是一个影响到分离提纯 也就是