可能影响IHC染色结果的实验小细节(阴性).doc

免疫组化实验操作注意事项一、可能导致掉片问题的实验细节1. 保证玻片已清洗干净并正确上胶，或购买迈新多聚粘附玻片。 玻片上胶检测方法：将洗净烘干的玻片在已经配制好的胶中沾一下，当玻片提起时，胶应呈一层均匀的水膜覆盖在玻片表面。如胶呈流水样流走，则说明玻片不够洁净，胶无法沾在玻片上，这样的玻片需重新清洗后再上胶。2. 组织脱水不完全，而造成切片困难，组织片表面毛糙，影响其粘附效果，造成掉片。3. 切片过厚也可能造成掉片，一般切片厚度不得超过4um。4. 烤片时间太短，温度过低。一般建议60度2小时为宜。另需注意使用的石蜡熔点，市场上一般的石蜡熔点在53-57度，但有一部分石蜡熔点在60度以上，若此时用60度烤片，温度就过低了，达不到石蜡熔点。5. 在高压修复过程中，建议适度控制火源大小（修复液烧至微沸后片架入锅，转为800-1000W火源加压），若使用2100W或更高瓦数，火力太猛，沸腾太剧烈，也有可能导致掉片。 6. 防止修复后骤冷骤热（易掉片）。建议修复完毕离开火源后，不要马上冲冷水，最好整锅室温冷却10分钟。7. 在进行细胞涂片时，若未经晾干，就直接入丙酮或95%酒精，由于二种液体张力不同，可能导致掉片。二、抗原修复注意事项一）按要求选择合适的抗原修复液注意查看抗体说明书，按照说明书的建议选择适合的抗原修复液。二）选择合适的修复方式。1. 不建议-微波修复：由于微波加热不均匀且温度无法达到100度或更高的温度，可能造成部分特别是抗原含量水平低的组织修复强度不够，组织局部修复不够，从而出现弱阳性、假阴性或者局部阳性的情况。建议最好使用高压修复，若条件限制只能使用微波，建议一定要保证修复时间（20分钟）。2. 推荐-高压修复（喷气后1.5-2分钟）：l 计时：高压修复计时时机掌握错误。未等均匀喷气，而是从片架入锅即开始。l 冷却：高压修复后习惯马上用冷水加速冷却，可能造成部分组织抗原没有充分暴露或组织出现脱片结果。冷却过程中不得将冷水直接喷入高压锅内，只能冲洗高压锅的外壁加速冷却。l 冲洗：冷却后，直接从容器取出，未经自来水或蒸馏水冲洗，直接冲PBS，容易造成染色结果略显灰。l 修复液：最好是配置好的当天使用，如果要重复使用，注意PH值，且在冷却的过程中避免修复液被污染。l 修复过程：须直接修复，不建议隔水修复，这样达不到直接水煮的修复强度和效果。l 修复器材：修复过程中不建议使用不锈钢或者铜制染色架可能对修复液的PH值有影响，进而影响抗原修复效果，建议使用耐高温的塑料染色架。3. EDTA水煮修复容器高度要足够，并且最好加盖。以避免修复结束后（20分钟）修复液蒸发大半，影响到修复效果，应保证整个修复过程中组织完全浸泡在修复液内。另外，同样不能隔水修复、应使用新鲜修配制的复液。4. 酶消化不论胰酶或者胃酶消化，在滴加消化酶之前，均需将孵育盒事先置入37度温箱预热，温箱的温度要恒定，若在室温下修复，可能造成多数组织抗原修复不够若孵育盒长期放置在温箱中，盒盖上常有水珠凝结，在孵育过程中水滴有可能滴落到玻片上，稀释试剂，影响修复效果及染色结果。三、 滴加试剂步骤注意事项1. 滴加试剂前：l 若存在甩片时边缘甩的不够，残留过多的冲洗液在组织上，片子过湿，将稀释试剂浓度，造成染色结果偏弱甚至假阴性。l 若切片边缘甩的过干，也有可能造成染色结果出现边缘效应。（若没有用油笔画圈的习惯，而是直接用纸巾擦干组织边缘的冲洗液，也可能会造成部分组织干片，进而出现非特异性的背景染色）2. 滴加试剂时，试剂瓶口离组织特别近，挤捏滴加后松开试剂瓶，液体能往瓶中回吸一些，有的老师认为这样能够节省试剂用量节约成本。极易使剩余的整瓶试剂受到污染而失效。3. 滴加试剂后，部分组织没有被试剂覆盖到，直接使用试剂滴瓶的瓶口在组织切片上涂抹，将试剂拨匀。很容易使试剂受到污染而导致试剂效价降低甚至失效。4. 使用移液器进行滴加时，杜绝将多余的试剂回收入试剂瓶。易污染剩余试剂。5. 当组织比较大，滴加的试剂量相对较少，可能会出现部分组织边缘没有被试剂覆盖到，可用牙签等工具将试剂拨散开来，但要注意拨散不同的抗体均需更换牙签。6. 滴加试剂时存在大的气泡在组织上方时，要将气泡去除，否则有可能造成染色结果弱阳性或假阴性。四、冲洗1. PBS冲洗需充分，若每次只冲洗一次，可能洗不干净，造成非特异背景。2. 冲洗瓶口距离切片过近，甚至碰触，可能污染冲洗瓶。3. 冲洗时直接敞开瓶口顺势将缓冲液倾倒于整个孵育盒中，如遇多片不同的指标染色时易造成污染。五、其他l 一抗孵育的时间温度需规范，一般建议室温（20度左右）1小