LAMP技术及应用参考幻灯片.ppt

2020年3月3日星期二 LAMP技术及应用 湖北省疾控中心结防所周丽平 1 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP技术 环介导等温扩增法 loopmediatedisothermalamplification LAMP 是一种在恒定温度下实现核酸的指数级扩增的技术已经被用来快速检测动物病原 病毒 细菌 寄生虫 LAMP技术因其特异 敏感 简便 快捷 检测方式对实验室基础设施 设备的要求较少 逐步用于结核分枝杆菌诊断鉴别中世界卫生组织于2016年8月11日 在日内瓦发布了一份最新的推荐书 推荐发展中国家的基础医疗单位使用该方法 可以作为痰涂片检测方法的替代方案 2 安徽省胸科医院 安徽省结防所 十三五 规划要求逐步推广的新诊断技术 3 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP技术的原理对靶基因的6个特异部位设定4种引物 利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成 从而使靶基因高效 快速 特异地扩增 4 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法使用的酶 链置换型DNA聚合酶 BstDNAPolymerase扩增对象为双链DNA时 其中一条链解离的同时进行链延长 LAMP法使用最适温度65 的聚合酶 2020年3月3日星期二 5 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法的引物设计 2020年3月3日星期二 6 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法的原理 2020年3月3日星期二 7 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法的原理 2020年3月3日星期二 8 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP技术特点 9 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法和其他PCR法的比较 2020年3月3日星期二 10 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法和其他PCR法的比较 2020年3月3日星期二 11 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法所需的试剂 2020年3月3日星期二 12 安徽省胸科医院 安徽省结防所 2020年3月3日星期二 LAMP技术简介 环介导等温扩增技术 Loop mediatedisothermalamplification LAMP 是由日本研究人员发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术 该技术可以在等温条件下 约65 进行核酸扩增反应 克服了传统PCR反应需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点 从而实现在恒温条件下进行连续快速的核酸扩增 并且可以通过简易直观的目测判读结果 相比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤 13 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法常规操作步骤 2020年3月3日星期二 14 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法的检测方法 琼脂糖凝胶电泳法由LAMP原理可知 LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组成的混合物 即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构 因此 LAMP扩增产物在2 的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯状条带 图A 肉眼观察法在LAMP反应过程中 可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行 图B 通过荧光染料检测有时 通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差 所以也可通过添加荧光染料 如溴化乙锭 EB SYBRGreenI等进行染色 来检测扩增是否发生 图C 2020年3月3日星期二 15 安徽省胸科医院 安徽省结防所 2020年3月3日星期二 16 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法在结核菌检测中的应用 2020年3月3日星期二 靶标限定 结核分枝杆菌复合群 gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因 在复合群进化过程中非常保守 LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标 临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群 包括结核分枝杆菌 牛分枝杆菌 田鼠分枝杆菌 非洲分枝杆菌 卡氏分枝杆菌 对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本 长远来说 更有利于避免耐药性的产生 17 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法在结核菌检测中的应用 2020年3月3日星期二 适宜的检测对象以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测对象 可避免假阳性过高 反应管预装反应体系扩增及检测在全封闭反应管中进行 有效降低气溶胶污染 用户操作简便 减少操作误差 结果易读产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果 技术特点 18 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法在结核菌检测中的应用 2020年3月3日星期二 临床试验 LAMP法和对照试剂 BD快速培养 对比结果 灵敏度 89 54 阳性结果预期值 98 13 特异性 98 93 阴性结果预期值 93 77 总符合率 95 31 19 安徽省胸科医院 安徽省结防所 LAMP法在结核菌检测中的应用 2020年3月3日星期二 临床试验 LAMP法和对照试剂 TB qPCR 对比结果 阳性一致率 88 56 阴性一致率 93 06 总符合率 91 36 20 安徽省胸科医院 安徽省结防所 WHO认为LAMP法的检测结果优于痰涂片检测 在已有肺结核症状的检测者中进行对比 TB LAMP法比痰涂片检测法多检出15 的患者 对比WHO近年推荐的其它快速检测法 如果把TB LAMP法用于对痰涂片检测阴性患者的复查 TB LAMP法检出率要高40 2020年3月3日星期二 21 安徽省胸科医院 安徽省结防所 2020年3月3日星期二 LAMP法在结核菌检测中的应用 现有结核诊断方法和环介导恒温扩增法比较 22 安徽省胸科医院 安徽省结防所 痰标本目测法检测流程 100分钟 23 一 样品处理 1 用2 3倍体积的4 NaOH溶液消化痰液2 吸取1mL痰液液化液加入无菌1 5mL离心管中 24 一 样品处理 2 13000r min离心10min 尽量吸弃上清 25 一 样品处理 3 沉淀用1mL生理盐水重悬洗涤 26 一 样品处理 4 13000r min离心10min 尽量吸弃上清5 重复步骤3 4一次 27 一 样品处理 6 向含沉淀物的离心管分别加入100 LDNA提取液 混匀后沸水浴10min 28 一 样品处理 7 冷却至室温后 13000r min离心 5min 上清即为核酸模板 29 二 核酸扩增 1 向反应管内按顺序分别加入阴性对照 待检模板和阳性对照各2 5 L 注意加样时枪头要穿透稳定液层加至反应管大腔内 盖紧管盖并做好标记 移至反应区 30 二 核酸扩增 2 置65 恒温反应60min 31 三 结果判断 1 反应结束 将反应管倒置甩动2次 再正置甩动2次 使工作液与显色液充分混合 32 三 结果判断 2 在阴性对照反应管液体颜色为无色 或橙色 阳性对照反应管液体颜色呈绿色的条件下 若待检样本反应管中液体颜色呈绿色 则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阳性 若待检样本反应管中液体颜色为无色 或橙色 则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阴性 若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符 则本次检测结果无效 应重新检测 33 1 LAMP结果为阳性 涂片结果也为阳性 可做出患者疑似患有结核病的诊断 并开始抗结核治疗 同时等待培养结果 2 LAMP结果阳性 而涂片结果为阴性 根据临床症状判断是否开始抗结核治疗 同时等待培养结果 这时可考虑增加一个或一个以上的标本进行LAMP检测以确认 如果增加的标本检测结果也为阳性 则患者可被初步诊断为患有结核病 并等待培养的结果 3 LAMP结果为阴性 涂片结果为阳性 应考虑LAMP结果是否受痰标本中的抑制物影响 并增加一个或一个以上的标本检测 若增加的标本检测结果仍不变 且排除抑制物因素 则患者可初步考虑为非结核分枝杆菌感染 进行进一步确诊