转基因育种与方法幻灯片

作物转基因育种就是根据育种目标 从供体生物中分离目的基因 经DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物 经过筛选获得稳定表达的遗传工程体 并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源 转基因作物 GMC geneticallymodifiedcrops 什么是转基因育种 与常规育种技术相比 转基因育种在技术上较为复杂 要求也很高 但是具有常规育种所不具备的优势 1 拓宽可利用的基因资源 2 培育高产 优质 高抗优良品种提供了崭新的育种途径 3 可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择 4 可以大大提高选择效率 加快育种进程 此外 还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品 Traditionalcrossbreeding RecombinantDNAtechniques 一 转基因技术的发展现状 第一节作物的转基因技术 自从1983年第一株转基因烟草获得以来 至今已有120种植物转基因获得成功 1996年全球大面积种植 并不断扩大 国际农业生物技术应用服务局 ISAAA 统计结果 世界银行下属机构预测 世界范围内转基因作物产业的交易额 2005年达到60亿美元 2010年达到200亿美元 1500万农民种植转基因作物种植国家先后有30多个国家批准了3000多例田间试验 涉及的植物种类有40多种 2000年有13个国家种植商品化转基因植物 2004年有17个国家种植商品化转基因植物 2004年 美国 59 阿根廷 20 加拿大 6 中国 5 欧洲5 2004年3月英国批准大面积种植转基因 但要求非常严格 2005年德国通过法案 严格限制 包括实验室研究 美国 3900万公顷加拿大 350万公顷阿根廷 1350万公顷中国 210万公顷 转基因作物种类主要为大豆 玉米 棉花和油菜等 以转基因大豆面积最大 根据美国农业部 USDA 2011年6月30日发布的最新数据 按种植面积计算 美国种植的88 的玉米 90 的棉花 94 的大豆 都是转基因品种 目标性状抗除草剂 抗虫和抗病毒病 美国三大转基因作物历年种植面积 Firstbiotechplantproduct Flav rSav rtomato 我国转基因作物研究与利用概况我国是世界上主要商品化种植转基因作物的国家 自行培育的双价转基因烟草的抗病虫性达到60 产量比对照增加15 产值增加20 1992年每亩增收200元 遗憾的是由于市场的原因现已不推广 到1999年我国已批准中试的转基因作物有48项 包括水稻 小麦 玉米 番茄 白菜 番木瓜 甜瓜 花生 棉花 烟草 广藿香等11种作物 主要目标性状是抗虫 抗病 耐盐 抗冻 耐储藏和抗衰老等 已批准环境释放的有49个品种 涉及水稻 玉米 大豆 马铃薯 番茄 甜椒 线辣椒 棉花 杨树 烟草等10种作物 经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有 我国自行研制开发的抗虫转基因棉花 转Bt及Bt CpTI双价抗虫棉 2004年种植转基因棉花370万公顷 占棉花种植面积的50 美国Monsanto公司开发的Bt抗虫棉 延迟成熟期的转基因番茄 抗黄瓜花叶病毒 CMV 转基因番茄 抗CMV转基因甜椒 转查尔酮合酶 CHS 反义RNA基因矮牵牛 转Bt毒蛋白基因的水稻转ACC反义合成酶的水稻 由中国农科院生物工程中心开发的Bt棉对棉铃虫有显著的抗性 与对照相比减少农药用量80 并减少用工150个 hm2 以上两者可使每公顷节省1500元 Bt转基因棉种深受棉农的欢迎 转基因技术简介 转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术 其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体 从而使该生物体具有表现某种性状 转基因通过获取基因 重组基因和表达基因等过程来实现 转基因打破了物种的界限 使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起 并且完全可以按照人的意志或目的 实现对生物体的改造 转基因的方法和原理 1目的基因制备和载体系统2几种有效的转基因方法3定点突变和受体系统 基本步骤 1 分离获得目的基因 2 在体外进行DNA重组 将外源DNA连接到能自我复制又带有选择标记的载体上 3 将重组DNA转移入受体细胞 4 筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆 分离基因 克隆到某中间载体 转化大肠杆菌 提取质粒 限制酶切 连接 克隆到植物表达载体 转化农杆菌 基因枪转化 pKS pBR332 pGEM T JM109 TOP10 HindIII EcroI T4ligase pBI121 pCAM1001 LBA4404 EHA 目的基因制备和载体系统 目的基因来源 基因组DNA分离 化学合成 PCR扩增 cDNA文库及DNA文库中制得 载体 质粒 噬菌体 柯氏质粒 YAC载体等工具酶 限制性内切酶 连接酶 DNA聚合酶等 一 目的基因的获得根据获得基因的途径主要可以分为两大类 根据基因表达的产物 蛋白进行基因克隆 从基因组DNA或mRNA序列克隆基因 1 根据基因表达的产物 蛋白进行基因克隆主要步骤如下 利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因 虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因 局限性 兼并密码子效率低未知基因及产物 分离蛋白质 明确氨基酸序列 推导核苷酸序列 人工合成 2 从基因组DNA或mRNA序列克隆基因 1 同源序列法 HomologyBasedCandidateGeneMethod 根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点克隆基因家族未知成员 氨基酸序列比较 设计简并引物 PCR扩增 文库筛选 RACE 2 表达序列标签EST是指能够特异性标记某个基因的部分序列 通常包含了该基因足够的结构信息区 可以与其它基因相区分 主要是通过cDNA的途径获得 获得EST的途径 大规模cDNA文库测序各种mRNA水平的分析手段 mRNA cDNA 反转录酶 cDNA文库 PCR 差异显示 抑制消减杂交 EST RACE 文库筛选 dbEST GenBank 3 根据连锁图谱克隆目的基因图位克隆技术 Map basedcloning Marker cM 1 0 8 a Gene c bp BAC 染色体步移 亚克隆 cDNA文库筛选 互补实验 精细定位 染色体步移 候选基因 4 转座子标签法转座子是染色体上一段可复制 移动的DNA片段 当转座子插入到某个功能基因内部时 就会引起该基因的失活 并诱导产生突变型 当转座子再次转座或切离这一位点时 失活基因的功能又可得到恢复 目前应用最为广泛的转座子系统是Ac Ds玉米转座子系统 插入突变体 筛选突变DNA文库 PCR RACE 鉴定性状遗传分析 转座子DNA探针 基因部分DNA探针 筛选野生型DNA文库 PCR RACE 完整目的基因 互补实验 5 差异显示法在生物个体发育不同阶段 或不同的组织与细胞中或不同环境下 基因表达差异 即不同基因有序的时空表达方式 叫做基因的差异表达 差异显示PCR differentialdisplay PCR DD PCR 是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增 电泳 并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带 叶mRNA 根mRNA 反转录 反转录 PCR 随机引物 3 锚定poly t 引物 PCR PAGE 叶 根 6 cDNA微阵列 cDNA芯片cDNA序列 纯样 机器点样在支持物 与荧光标记的不同mRNA样品分别进行杂交 通过激光共聚焦扫描分析不同cDNA序列的杂交信号强度 判断该cDNA在不同mRNA样品中的表达丰度 mRNA1 mRNA2 6 电子克隆insilicocloning借助于电子计算机 利用公布的核酸序列资料 进行序列的拼接和组装最终获得完整基因序列的技术 类似于cDNA文库的筛选但更加方便和快速 PCR反应 PCR技术就是在体外通过酶促反应或自发地扩增一段目的基因的技术 PCR要求反应体系具有以下条件 1 要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物 约20个碱基左右 2 具有热稳定性的酶如TaqDNA聚合酶 3 4种dNTP 4 作为模板的目的DNA序列 PCR反应可扩增出100 5000bp的目的基因 PCR反应过程 1 变性 即将模板DNA置于95 的高温下 使双链DNA的双链解开变成单链DNA 2 退火 将反应体系的温度降低至55 左右 使得一对引物分别与变性后的两条模板链相配对 3 延伸 将反应体系温度调整到TaqDNA聚合酶作用的最适温度72 然后以目的基因为模板 合成新的DNA链 反复进行约30个循环左右 即可扩增得到目的DNA序列 利用cDNA法 由于真核生物的mRNA具有polyA这一结构特点 可以用结合长度大约为15bp的短链多聚DT的纤维素填充的柱子 根据碱基配对原则 将其吸附 从真核细胞的总RNA中提取出来 再用能打断A T氢键的缓冲液洗脱 在mRNA群体中 有高丰度的mRNA 拷贝数多 也有低丰度的mRNA 但种类多 高丰度的mRNA容易合成cDNA 要保证构建的cDNA文库中要含有目的克隆 可利用琼脂糖凝胶电泳 非变性蔗糖梯度离心和羟甲基蔗糖剃度离心等分级分离不同长度的mRNA 也可以利用cDNA的大小分级分离 cDNA链的合成 得到纯化的mRNA后 再利用逆转录酶和DNA聚合酶I 缓冲液和4种脱氧核糖核苷三磷酸及短的digo dT 分子作为引物 合成cDNA 这些cDNA是由该种生物的各种mRNA分子逆转录得到的 因此是混合物 它们可以通过末端连接或是加入衔接物等其它方法克隆进入质粒载体 形成cDNA文库 然后 采用DNA杂交或免疫分析的方法来筛选目的基因 二 目的基因重组质粒的构建 目的基因体外重组到适当的已改造的质粒中包括保存用中间载体 大肠杆菌寄主 pBR322 pUC pBluescriptK pKS pGEM T繁殖载体 大肠杆菌寄主 JM109 TOP10植物转化载体 农杆菌寄主 pBI121 pCAM1001 质粒载体 质粒 plasmid 是能自我复制的双链环状DNA分子 它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在 每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列 它能帮助质粒DNA在宿主细胞中复制 高拷贝数的质粒 在宿主细胞中能达10 100个拷贝 低拷贝数的质粒 在宿主细胞中只有1 4个拷贝 质粒要成为克隆载体 就必须进行遗传改造 使之成为一个具有单一的限制性内切酶识别位点 多个选择性标记 质粒载体pBR322 1 大小为4361bp 含有抗氨苄青霉素和抗四环素这样两个抗生素抗性基因2 在四环素抗性基因内部 还具有BamHI Hind 和SalI三个识别位点 3 PstI识别位点在氨苄青霉素抗性基4 pBR322带有一个复制起点 可以保证质粒只在大肠杆菌里进行复制功能 pUC19质粒 长2686bp 带有pBR322的复制起始位点 一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子 半乳糖苷酶基因 lacZ 的调节片段 一个调节lacZ 基因表达的阻碍蛋白的基因lacI 还有多个单克隆位点 pUC19的筛选将转化细胞涂布到含有氨苄青霉素 IPTG和X gal的固体培养基上 那些带有自身环化质粒的细胞由于能够形成具活性的 半乳糖苷酶 所以菌落是蓝色 如果插入有目的DNA片段 无法形成杂合 半乳糖苷酶 菌落时白色的 噬菌体 噬菌体染色体是长约49kb的双链DNA 该DNA的两个5 末端都是由12个bp组成的单链互补粘性末端 当 噬菌体DNA进入宿主细胞后 这两个粘性末端互相结合 在连接酶作用下封闭成环在 噬菌体基因组中位于左边的基因 A J 编码噬菌体头部和尾部的蛋白质 中间的基因 J N 与重组和生长过程有关 但与裂解生长过程无关 因此对裂解生长过程来说 中间区的DNA是非必需的 可以被缺失或置换 因此可以在这个区域克隆外源DNA 右边的基因涉及 基因的表达 调节 DNA合成晚期功能调节以及宿主细胞裂解等 噬菌体载体 分类 插入型载体和置换型载体 插入型载体 具有单一的酶切位点 可供外源DNA的插入 置换型载体 有成对的酶切位点 在两个酶切位点之间的DNA片段 可被外源DNA片段置换 噬菌体载体可以克隆较大DNA片段 最大长度约为24kb 只需将 噬菌体DNA 尾巴和纯化的空的头 混在一起就可以在体外产生具有侵染性的噬菌体颗粒 柯氏质粒Cosmid 柯氏质粒可克隆携带40kb大小的DNA片段 并在大肠杆菌中复制保存 综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优点 柯氏质粒上带有多个单克隆位 RE2 两个cos位点 DNA复制起始位点和抗生素抗性基因 在两个cos位点之间还有一个限制性内切酶位点 RE1 分离基因 克隆到某中间载体 转化大肠杆菌 提取质粒 限制酶切 连接 克隆到植物表达载体 转化农杆菌 基因枪转化 pKS pBR332 pGEM T JM109 TOP10 HindIII EcroI T4ligase pBI121 pCAM1001 LBA4404 EHA 几种有效的转基因方法 概括起来说主要有两类 第一类是以载体为媒介的遗传转化 也称为间接转移系统法 基因转移 transgenosis 是借助于物理 化学或生物的手段将外源基因导入受体细胞 并检查其在该细胞内表达情况的一种技术 是细胞工程中一项重要而应用广泛的技术 第二类是外源目的DNA的直接转化 细胞直接摄取外源DNA的过程称为转化 transformation 如果通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程 称为转导 transduction 转基因技术动物TransgenicAnimal1976年Jaenisch等获得含有SV40DNA的嵌合体小鼠 1980年 Gordon应用显微注射法首次成功地将重组的外源DNA直接注入小鼠受精卵雄原核中 获得了携带外源基因小鼠 1982 Palmiter将大鼠的生长激素基因用微注射方法导入小鼠的受精卵中获得巨型小鼠 supermouse 从而在理论上和实践意义上都将转基因技术提高一步 引起生物学界极大的关注 为基因工程育种提供诱人的前景 早期以提高生长为主 以生产药用蛋白和可移植的器官 谈家桢院士 左 著名老中医徐蔚霖教授 右 曾溢滔院士 中 转基因试管牛 滔滔 转基因熊猫狗 动物转基因的方法 显微注射DNA 显微注射DNA一般是用微吸管加DNA溶液在显微镜下准确地插入受体细胞核中 并将DNA注射进去的方法 在动物细胞转移中较常使用 现在 多利用显微镜操作器在相差显微镜下进行操作 每个细胞的注射量约为10 11ml 熟练的操作者每10分钟可注射200个细胞 显微操作仪 显微操作仪的使用 显微操作仪使用杠杆操作而移动 它能靠杠杆操作把微吸管的先端在显微镜的视野中作平面移动 上下的运动靠设在显微操纵仪支柱上的上下微动 粗动调节装置进行 它与显微镜牢固地连接起来 右侧的显微操作仪是装在显微镜本体上 左侧的显微操作仪是装在显微镜的机械台上 随机械台的移动而移动 一般在进行操作时 先将平皿放置在显微注射仪上 移动载物台 把视野移到细胞处 先用缓慢移动显微操纵仪上固定细胞的微吸管 同时使注射器缓慢减压 吸引目标受精卵并固定之 再用另一侧显微操纵仪移动微注射针 对准细胞核刺入 导入目的基因 完成显微注射 显微注射法的优点 1 转化率高达20 特别是在没有合适的DNA载体系统时更有价值 2 对各种受体细胞均适用 从体细胞 淋巴细胞到受精卵 3 对转移物质没有限制 可以是DNA RNA 蛋白质 病毒 代谢物或代谢底物以至细胞器 染色体 细胞核 4 可以控制转移的量和转移物的浓度 5 可选择受体细胞的核的接受位点 可研究物质在细胞内的运转 区隔化和依赖区隔的修饰 6 受体不用特殊的选择系统 7 要求的样品量少 2ml样品足够作显微注射 8 实验细胞与对照细胞可以化同样的条件下比较 但也有缺点 如设备和技术的要求较高 一次处理细胞数量不能太多 对细胞有损伤 2 逆转录病毒介导法 3 胚胎干细胞法 4 精子载体法意大利Lavitrano等1989年首次报道利用精子作为载体获得了转基因小鼠 5 细胞核移植法 277次乳腺细胞核移植实验 获得29个发育为8细胞的 胚 13头代孕母亲 1996年7月5日 羊羔6LL3 被命名为 多莉 6 生殖细胞转染法 DNA 磷酸钙沉淀法 磷酸钙沉淀反应是将外源DNA转移并整合到细胞株中去的最常用方法 主要用于将基因导入动物细胞 由于核酸以磷酸钙 DNA共沉淀物的形式存在 培养细胞对DNA的吸收会大大提高 细胞通过内吞作用 使DNA进入细胞质 并转移整合到细胞核内的染色体内 一般是将DNA与CaCl2溶液混合后 同时加入HEPES缓冲的盐溶液 HeBS 混合 静置后形成DNA 磷酸钙沉淀物 然后用来转染受体细胞 这个过程中 pH值 Ca2 浓度等都会对转染的效率有所影响 方法简单 效率较高 可达培养细胞的20 但缺点是受体细胞有限 脂质体 liposome 介导的基因转移 脂质体是一种内部包装DNA的球状磷脂双分层膜结构 能与细胞膜融合将DNA送入细胞的 用脂质体介导DNA转染各种不同的类型的真核细胞的方法具有较高的转化效率和可重复性 脂质体制备的基本方法是以一定比例称取磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸 放于氯仿中之后加入待转移的DNA分子制成悬液 经超声化处理后 即形成包含DNA分子的脂质体 然后与培养细胞作用2小时左右 就可望实现DNA导入受体细胞 脂质体介导的基因转染率受脂质体的组成及理化性质的影响 脂质体可以实现体内和体外的瞬时稳定表达 基因枪介导的DNA转移 基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的 它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内 从而实现基因转化的方法 1992年 世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的 基因枪转化的原理 2 基因枪轰击法 微弹轰击技术micro projectilebombardment 将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面 借助高压动力射入受体细胞或组织 最后整合到植物基因组并得以表达 步骤简单易行 适合于大多数细胞或组织 克服了受体材料的限制 不必制备原生质体 具有相当广泛的应用范围 已经成为植物细胞转化最有效方法之一 到目前为止 利用基因枪法已经在烟草 豆类和多数禾本科农作物 果树花卉和林木等植物上获得转基因植株 决定基因枪使用成功的因素 第一因素是动力系统 根据动力系统 基因枪分为三大类 一类是以火药爆炸力作为动力加速微弹 第二类是以电弧放电蒸发浪作为动力 第三类是以高压气体作为动力 第二因素是微弹的制备过程 用的微载体有两类 一是钨粉 另一个是金粉 直径一般为0 6 4 m 常用的将DNA包被到微载体上所用的沉淀试剂有亚精胺 氯化钙 乙醇 聚乙二醇 异丙醇等 第三个因素是受体材料的选择 转基因植物方法 第一类是以载体为媒介的遗传转化 也称为间接转移系统法 第二类是外源目的DNA的直接转化 1 载体介导转移系统最常见的转基因方法 将外源基因重组进入适合的载体系统 通过载体将携带的外源基因导入植物细胞 整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达 农杆菌Ti质粒 tumor inducingplasmid 或Ri质粒 root indcingplasmid 介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多 机理最清楚 最理想的载体转移方法 农杆菌与植物细胞相互作用的机制 土壤农杆菌转化法 农杆菌 usedextensivelyforgeneticengineeringofplants 包含Ti质粒Tumorinducingplasmid bacterialplasmid T DNA Transferred DNA 可以转移进入植物基因组 TumorinducedbyA tumefaciens TiPlasmid T DNAregion Leftborder Rightborder virgenes ori 已知农杆菌附着到植物细胞后 只留在细胞间隙中 T DNA首先在细菌中被加工 剪切 复制 然后转入植物细胞 auxin Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质 为双股共价闭合的环状DNA分子 其分子量为95 156 106D 约有200kb组成 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同 Ti质粒可以被分成四种类型 章鱼碱型 octopine 胭脂碱型 nopaline 农杆碱型 agropine 农杆菌素碱型 agrocinopine 或称琥珀碱型 succinamopine Ti质粒的遗传特性及类型 Ti质粒的功能区域 1 T DNA区 transferred DNAregions 农杆菌侵染植物细胞时 从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA 称为转移DNA 该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关 2 Vir区 virulenceregion 该区段上的基因能激活T DNA转移 使农杆菌表现出毒性 T DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻 约占Ti质粒DNA的三分之一 3 Con区 regionsencodingconjugations 该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因 tra 调控Ti质粒在农杆菌之间的转移 冠瘿碱能激活tra基因 诱导Ti质粒转移 因此称之为接合转移编码区 4 Ori区 originofreplication 该区段基因调控Ti质粒的自我复制 故称之为复制起始区 2 外源基因直接导入法 1 化学刺激法细胞融合剂 聚乙二醇 PEG 聚乙烯醇 PVC 2 基因枪轰击法 微弹轰击技术micro projectilebombardment 将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面 借助高压动力射入受体细胞或组织 最后整合到植物基因组并得以表达 步骤简单易行 适合于大多数细胞或组织 克服了受体材料的限制 不必制备原生质体 具有相当广泛的应用范围 已经成为植物细胞转化最有效方法之一 到目前为止 利用基因枪法已经在烟草 豆类和多数禾本科农作物 果树花卉和林木等植物上获得转基因植株 单子叶植物 1 Pericarpsholudbepulledbackandtheimmatureembryos 0 5 1 0mm areremoved 2 Theimmatureembryosareplacedonacallusinductionmedium highosmoticmediapreparecallifortransfomation Transformationisperformedbygenegunmethod 3 微注射法细胞操作 利用琼脂糖包埋 聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞 原生质体或生殖细胞 固定 然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞 子房注射法或花粉管通道法 具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作 操作简便 成本低 五 转化体的筛选和鉴定1 转化体的筛选外源目的基因转化频率低目的基因已被整合到核基因组并表达转化细胞更少使用特异性选择标记基因 selectablemarkergenes 进行标记 有效地选择出真正转化细胞 常用选择标记基因 抗生素抗性基因除草剂抗性基因将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因 克隆到质粒载体上 与目的基因同时进行转化 标记基因在受体细胞表达 使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来 非转化细胞则被抑制 杀死 载体构建中常用的选择标记 如何选择和筛选转化体同样是一个重要问题 科学家家一直试图把转化体带上一个标记 从而便于选择和筛选 至今己建立了许多标记基因 并已插入各种转化载体中 作为一种标记基因 作为标记基因 必须具备以下四个条件 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶 基因较小 可构成嵌合基因 能在转化体中得到充分表达 检测容易 并且能定量分析 细菌筛选标记基因 产物给予细胞产生一种选择压力 致使未转化细胞不能生长 发育与分化 而转化细胞对该标记产生抗性 不影响其生长等 从而将转化细胞选择出来 例如 Cat 氯霉抗性基因 植物筛选标记基因 强调给转化细胞带上一种标记 起报告和识别作用 故称报告基因 报告基因 Gus基因 葡糖苷酸酶基因 在植物细胞中所产生的葡糖苷酸酶在检测上具有以下特点 在一定条件下与X G1ucuionicacid 5 bromo 4 chioro 3 indoyl D glucuronicacid 底物发生作用 产生蓝色沉淀 既可以用分光光度计法测定 又可以直接观察到植物组织中形成的蓝色斑点 当加入4 甲基伞形酮基和葡萄糖苷酸时生成4 甲基伞形酮 发荧光 465nm 因而可以用荧光光谱法测定 由于荧光强度高 本底低 故荧光检测极为灵敏 检测容易 迅速并能定量 只需少量植物组织抽提液即可在短时间内测定完毕 价格便宜 GFP 绿色荧光蛋白基因 LUC 萤火虫荧光素酶基因 报告基因 表达荧光的转基因鱼 启动子的选择 35S cauliflowermosaicvirus35Spromoter CaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues 三 受体材料的选择受体是指用于接受外源DNA的转化材料 良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件 1 高效稳定的再生能力 2 受体材料要有较高的遗传稳定性 3 外植体来源方便 如胚和其它器官等 4 对筛选剂敏感 5 转化率高 常用的受体材料有以下几大类型 1 愈伤组织再生系统外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织 转化 带有目的基因质粒的农杆菌侵染 分化培养获得再生植株 优点 外植体来源广 繁殖快 易接受外源基因 转化效率高 缺点 遗传稳定性差 嵌合体因此需要连续的再生系统 2 直接分化再生系统外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段 而是直接分化出不定芽形成再生植株 优点 周期短 操作简单 体细胞变异小 遗传稳定 缺点 材料局限 转化率低 3 原生质体再生系统原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力 是应用最早的再生受体系统之一 优点 高效 广泛地摄取外源DNA或遗传物质 获得基因型一致的克隆细胞 所获转基因植株嵌合体少 适用于多种转化系统 缺点 不易制备 再生困难和变异程度高 4 胚状体再生系统是指具有胚胎性质的个体 优点 个体数目巨大 同质性好 接受外源基因能力强 嵌合体少 易于培养 再生 缺点 技术含量高 多数植物不易获得胚状体 5 生殖细胞受体系统以生殖细胞如花粉粒 卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统 一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养 转化受体系统 二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化 如花粉管导入法 花粉粒浸泡法 子房微针注射法等 转化体的鉴定通过筛选得到的再生植株初步证明标记基因整合进入受体细胞 至于目的基因是否整合到受体核基因组 是否表达 还必须对抗性植株进一步检测 DNA水平的鉴定检测内容 是否整合 拷贝数 整合位置 检测方法 特异性PCR 以外源基因两侧序列设计引物 Southern杂交 外源目的基因序列为探针 特异性PCR检测外源基因整合到受体 2 转录水平的鉴定常用的方法Northern杂交 标记的RNA为探针对总RNA杂交 RT PCR检测 mRNA cDNA PCR 3 翻译水平的鉴定为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译 还必须进行翻译或者蛋白质水平检测 主要方法 Western杂交免疫检测 六 转化体的安全性评价和育种利用根据有关转基因产品的管理规定 在可控制的条件下进行安全性评价和大田育种利用研究 通过转基因方法往往难以直接获得理想的品种 系 原因 外源基因失活 纯合致死 花粉致死 其它性状变化等 因此获得转化体后 应结合杂交 回交 自交等常规转育手段 最终选育综合性状优良的转基因品种 第三节转基因作物的生物安全性 直至今天 转基因作物的安全性在全球范围内引起了激烈的争论 反对者认为转基因作物具有极大的潜在危险 可能会对人类健康和人类生存环境造成威胁 在欧洲 转基因作物被一些媒体称之为 恶魔食品 frankensteinfood Frankenstein是英国科幻小说中由一个科学家创造 最终又毁灭了这个科学家的怪物 那么 人类研制与种植转基因作物到底是毁灭自己 还是拯救自己呢 对转基因作物的安全性争论 国际上有几个典型的事件 Pusztai事件 英国Rowett研究所有位Pusztai博士 他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠 1998年秋天在英国电视台发表讲话 声称大鼠食用了这种土豆后 体重和器官重量减轻 免疫系统受到了破坏 后果 绿色和平组织 地球之友等反生物技术组织把这种土豆说成 杀手 并策划了破坏转基因作物试验地等行动 焚烧了印度的两块试验田 甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏 以致研究生毕业论文都无法如期完成 英国皇家学会组织了同行评审 并于1999年 月发表评论 指出Pusztai的试验有六方面的错误 不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异 对食用转基因土豆的大鼠 未补充蛋白质以防止饥饿 供试动物数量少 饲喂几种不同的食物 且都不是大鼠的标准食物 缺少统计学意义 试验设计差 统计方法不当 试验结果无一致性等 斑蝶事件 1999年5月 康奈尔大学的一个研究组在 Nature 杂志上发表文章 声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫 马利筋 的杂草上 用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶 导致44 的幼虫死亡 这一实验结果在科学上没有说服力 玉米的花粉非常重 扩散不远 在玉米地以外 米 马利筋叶片 CM2上只找到一个玉米花粉 2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明 抗虫