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第五章蛋白质结构解析 1 精选课件 人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍 如此少的基因是如何创造出人体如此复杂的生命活动 人体基因的主要功能是通过蛋白质来实现的 蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角色 人体中大约有10万种蛋白质 测定蛋白质结构的意义 2 精选课件 蛋白质三维结构解析方法X 射线晶体衍射法 85 3 核磁共振波谱 14 7 电镜三维重构 各种光谱技术 显微技术和计算机模拟 3 精选课件 蛋白质三维结构解析过程 4 精选课件 5 精选课件 6 精选课件 1895年11月8日 德国物理学家 50岁的伦琴在自己的实验室中偶然发现一种从阴极射线管中辐射出的新型射线 由于对管子发出的 东西 性质不确定 伦琴就把这种射线命名为 X射线 图片出处 伦琴实验室 第一节X 射线衍射测定蛋白质结构 7 精选课件 人类第一张X光照片 图片出处 伦琴妻子之手 8 精选课件 1896年1月23日伦琴将这一重大发现在维尔兹堡物理医学会上报告 Kolliker教授提议将该射线命名为 伦琴射线 但伦琴却说 我还没有彻底解释这种射线的发生现象 还是称它为X射线最恰当 威廉 康拉德 伦琴WilhelmConradR ntgen 9 精选课件 1901年第一届诺贝尔物理学奖评选时 29封推荐信中就有17封集中推荐他 伦琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金 图片出处 诺贝尔物理奖奖章 10 精选课件 X射线本质 X射线是一种短波长 0 005 10nm 高能量 2 5 105 1 2 102eV 的电磁波 它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下 产生跃迁而发射的电磁辐射 11 精选课件 一般由高速电子撞击金属产生 如图所示 是一种产生X射线的真空管 K是发射电子的热阴极 A是由钼 钨或铜等金属制成的阳极 两极之间加有数万伏特的高电压 使电子流加速 向阳极A撞击而产生X射线 A 12 精选课件 X射线衍射 1912年MaxvonLaue发现X射线具有衍射的现象 1914年的诺贝尔物理学奖 图片出处 13 精选课件 劳厄的实验装置 图片出处 14 精选课件 X 射线晶体结构分析基本原理 X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象X射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构 当X射线入射到样品晶体分子上时 分子上的每个原子使X射线发生散射 这些散射波之间相互叠加形成衍射图形 衍射图形能给出样品内部结构的许多资料 如原子间的距离 键角 分子的立体结构 绝对构型 原子和分子的堆积 有序或无序的排列等 15 精选课件 X射线通过红宝石晶体 a 和硅单晶体 b 所拍摄的劳厄斑 图片出处 16 精选课件 劳伦斯 布拉格 LawrenceBragg 亨利 布拉格 HenryBragg 因在用X射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡献 亨利 布拉格 WilliamHenryBragg 和劳伦斯 布拉格 WilliamLawrenceBragg 父子分享了1915年的诺贝尔物理学奖 图片出处http 202 202 4 150 nobel nobel1 htm 图片出处http nobelprize org physics laureates 1915 wl bragg bio html 17 精选课件 20世纪60年代解析一个蛋白质结构可以获得诺贝尔奖 20世纪70年代解析一个蛋白质结构则可成为轰动世界的新闻 20世纪80年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位 20世纪90年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位 今天 一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构 但如果没有深入研究其结构与功能的关系 往往不能毕业 蛋白质结构解析的发展 饶子和院士 HIV基质蛋白 SARS 18 精选课件 射线衍射用于蛋白质结构的测定 1954年伯纳尔 Bernal 获得第一张胃蛋白酶晶体 衍射图片 19 精选课件 1957年肯特罗 Kendrew 完成肌红蛋白的0 6nm分辨率的蛋白质晶体结构 图片出处 http www drg de data wuerdigungen Nobelpreise RoenNobel htm 图片出处 http www2 mrcmb cam ac uk archive gal source kendrew html 20 精选课件 肌红蛋白的三维结构 肌红蛋白的三维结构模型 图片出处 图片出处 http www2 mrc lmb cam ac uk archive Kendrew62 html 21 精选课件 1959年佩鲁茨 Perute 完成血红蛋白0 55分辨率的晶体结构 图片出处 http www hsgq pudong 22 精选课件 血红蛋白的四级结构模型 图片出处 血红蛋白分子就是由二个由141个氨基酸残基组成的 亚基和二个由146个氨基酸残基组成的 亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子 每个亚基中各有一个含亚铁离子的血红素辅基 四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋白分子严密的空间构象 23 精选课件 由于测定出蛋白质的精细结构 两位英国科学家M F 佩鲁茨和J C 肯德鲁获得1962年的诺贝尔化学奖 图片出处 24 精选课件 1997年 核小体八组蛋白结构2004年 菠菜捕光复合物LHC II 25 精选课件 2005年 线粒体膜蛋白复合物2精细结构 26 精选课件 X射线衍射测定蛋白和核酸精细结构 为新药设计提供了全新方向 中国科学家研制抗癌新药首获瑞典爱明诺夫奖 27 精选课件 施一公抗癌抗乙肝病毒新药Birinapant 进入临床二期 28 精选课件 蛋白质X射线晶体结构测定程序 1 样品制备2 蛋白质结晶和晶体生长3 衍射数据收集和处理4 位相求解5 模型建立和修正 29 精选课件 1 样品制备 大量表达 分离和纯化目标蛋白 一般要求纯度大于97 浓度达到5mg ml以上 30 精选课件 2 蛋白质结晶和晶体生长 蛋白质结晶原理与小分子结晶一样 蛋白质在溶液中处于过饱和状态时 分子间可以规则的方式堆积起来形成晶体析出 31 精选课件 蛋白质晶体生长的影响因素 物理因素 温度 重力 压力 震动 时间 电场磁场 介质的电解质性质和粘度 均相或非均相成核等化学因素 pH值 沉淀剂类型和浓度 添加剂 离子种类 离子强度 过饱和度 氧化还原环境 蛋白质浓度等生化因素 蛋白质纯度 配合体 抑制剂 化学修饰 遗传修饰 蛋白质的聚集状态 蛋白质水解 蛋白质自身的对称性 蛋白质的稳定性和等电点等 32 精选课件 蛋白质结晶方法 1 批量结晶法 Batchcrystallization 2 透析法 Dialysis 3 液相扩散法 Liquiddiffusion 4 气相扩散法 Vapourdiffusion 5 蛋白质结晶新方法 33 精选课件 1 批量结晶法 Batchcrystallization 通过在待测结晶蛋白质溶液的体积 浓度和组成固定的条件下 直接将不同量的饱和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶液中结晶 34 精选课件 35 精选课件 2 透析法 Dialysis 利用半透膜允许小分子透过而大分子不能透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓度 pH或离子强度 从而使蛋白质溶液缓慢形成过饱和状态以形成晶核 该法是培养蛋白质晶体的常用方法 36 精选课件 37 精选课件 3 液相扩散法 Liquiddiffusion 利用液相平衡原理而设计的 由于蛋白质在不同溶液中的溶解度不同 把待结晶蛋白质溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂中 在界面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过饱和 从而促使晶核形成 38 精选课件 4 气相扩散法 Vapourdiffusion 把待结晶蛋白质 高于此蛋白质结晶所需盐浓度的溶液和低于这种浓度的盐溶液放在一个密闭体系内 两种浓度不同的溶液由于发生蒸汽扩散最后达到平衡 随着溶液中沉淀剂浓度的增加蛋白质溶解性降低 从而蛋白质达到过饱和而析出晶体 39 精选课件 40 精选课件 5 结晶新方法Nucleant生物玻璃 41 精选课件 晶体初步鉴定偏光显微镜观察 染色 电泳等 42 精选课件 3 衍射数据收集和处理 第三代同步辐射光源的应用使得用20 40um大小的晶体解析高分辨率结构已经成为现实目前世界上比较著名的同步辐射工作站有多个 APS USA ESRF France SPring 8 Japan 43 精选课件 上海同步辐射中心 同步辐射光源 44 精选课件 晶体收集和储存 液氮气冷技术 45 精选课件 4 位相求解 1 分子置换法 MR 2 多对同晶型置换法 MIR 3 多波长反常散射法 MAD 实验中经常联合使用 46 精选课件 分子置换法 MR 分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子放到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始结构模型并借助此模型计算待测蛋白质晶体各个衍射点的相角的方法 47 精选课件 多对同晶型置换法 MIR 在蛋白质晶体中引入散射能力强的重金属原子如Pb和Hg等作为标志原子 制备出重原子的衍生物 然后求出这些重原子在晶胞中的坐标 根据坐标计算出重原子散射波在各个衍射点的相角 最后推测出蛋白质分子在各个衍射中的位相 48 精选课件 多波长反常散射法 MAD 利用同步辐射波长连续可变的特点 使用一个重原子衍生物作为母体 用一个晶体就可以收集到重原子反常散射吸收边两侧的多套数据 并解出结构 49 精选课件 5 模型建立和修正 晶体学R因子一般要求达到0 2以下键长偏差大约为0 015 键角偏差约为3 二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构象是随机的外 其他残基的二面角构象分布受到立体化学的限制 50 精选课件 X Ray晶体衍射目前仍然是蛋白质三维结构测定的主要方法优点 分辨率高 能精确确定生物大分子中各原子的坐标 键长 键角 给出生物大分子的分子结构和构型 确定活性中心的位置和结构缺点 只能测定单晶 反映静态结构信息 无法测定溶液中的信息 51 精选课件 成为推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法 核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是唯一可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法 目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象 扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数 成为一种引人注目的癌症早期诊断技术 第二节NMR测定蛋白质结构 52 精选课件 核磁共振技术 NMR 1946年美国斯坦福大学的F Bloch和哈佛大学的E M Purcell两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象 为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖 1983年 瑞士科学家KurtW thrich教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素 glucagon 多肽的溶液构象 发明了利用核磁共振 NMR 技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了2002年度诺贝尔化学奖 74岁的美国科学家保罗 劳特布尔和70岁的英国科学家彼得 曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主 53 精选课件 54 精选课件 NMR基本原理 核磁共振 NuclearMagneticResonance 就是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时 共振吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程 核磁共振波谱仪 核磁共振波谱是测量原子核对射频辐射 约4 600MHz 的吸收 这种吸收只有在高磁场中才能产生 55 精选课件 15 56 精选课件 57 精选课件 58 精选课件 核磁共振波谱仪 59 精选课件 核磁共振波谱仪 1 永久磁铁 提供外磁场 要求稳定性好 均匀 不均匀性小于六千万分之一 扫场线圈 2 射频振荡器 线圈垂直于外磁场 发射一定频率的电磁辐射信号 60MHz或100MHz 60 精选课件 3 射频信号接受器 检测器 当质子的进动频率与辐射频率相匹配时 发生能级跃迁 吸收能量 在感应线圈中产生毫伏级信号 4 样品管 外径5mm的玻璃管 测量过程中旋转 磁场作用均匀 61 精选课件 如果一个人知道了一间房子的所有尺寸 就可以画出房子的三维图形 同样 如图所示 通过测量蛋白质中的大量的短距离 就可以画出其结构的三维图像 瑞士科学家库尔特 维特里希则发明了 利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构法 这种方法的优点是可对溶液中的蛋白质进行分析 进而可对活细胞中的蛋白质进行分析 能获得 活 蛋白质的结构 其意义非常重大 这种方法的原理可以用测绘房屋的结构来比喻首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对象 然后测量所有相邻拐角间的距离和方位 据此就可以推知房屋的结构 维特里希选择生物大分子中的质子 氢原子核 作为测量对象 连续测定所有相邻的2个质子之间的距离和方位 这些数据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图 62 精选课件 核磁共振法中几个常用的参数 化学位移耦合常数NOE 核欧沃豪斯效应 信号强度谱峰面积弛豫时间 63 精选课件 1 化学位移 值越大 表示屏蔽作用越小 吸收峰出现在低场 值越小 表示屏蔽作用越大 吸收峰出现在高场 64 精选课件 2 耦合常数 核与核之间以价电子为媒介相互耦合引起谱线分裂的现象称为自旋裂分 由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋 自旋耦合常数 用J表示 耦合常数用来表征两核之间耦合作用的大小 J耦合常数大小主要与连接两个核的化学键数目有关 与影响标量耦合核之间电子云分布的因素有关 65 精选课件 3 NOE信号强度 当分子内有两个空间距离小于0 5nm的原子核时 如果用双共振法照射其中一个核 使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线达到饱和 则另一个靠近的原子核的共振信号就会增加 这种现象称核欧沃豪斯效应 NOE 66 精选课件 4 谱峰面积 谱峰面积和分子中同一化学环境的原子核数目的多少成正比 因此峰面积的积分值可用来做定量分析的基础 67 精选课件 5 弛豫时间 原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程 它所需的时间叫弛豫时间 自旋晶格弛豫 处于高能态的氢核 把能量转给周围的分子 回到低能态 自旋 自旋弛豫 两个进动频率相同 进动取向不同的磁性核 在一定距离内时 它们相互交换能量 改变进动方向 68 精选课件 二维核磁共振 2DNMR NMR可获得分子内各核的化学环境 核间的耦合关系 空间构象等信息 但是当分子较大的时候 由于裂分谱线间的重叠 因此在测定了同一种核的一维谱之后 需要了解两种或三种不同核之间的联系关系 如C H N H等就需要用到2DNMR 它是2个频率变量的函数 吸收峰对2个频率变量作图 1H 1HCOSY 1H 15NHSQC 69 精选课件 多维核磁共振 1H 13C 15N核之间的化学键连接来得到核磁共振相关信号 CBCANH HNCO HCCH COSY 核磁共振本身不能展示样体的内部结构 要得到内部的图像 就要将不同梯度的磁场加以结合 即改变穿过样本的磁场强度 这样就有无数二维的图像 彼此重叠后就得到样本内部空间的三维图像 70 精选课件 核磁共振技术的应用 早期核磁共振主要用于对核结构和性质的研究 如测量核磁矩 电四极距 及核自旋等后来广泛应用于分子组成和结构分析 生物组织与活体组织分析 病理分析 医疗诊断 产品无损监测等方面 71 精选课件 1985年 维特里希等人公布了第一次利用NMR法测定的溶液中蛋白质 蛋白酶抑制剂IIA proteinaseinhibitorIIA 的结构 72 精选课件 NMR图谱得到的蛋白质三维结构 from 厦门大学生命科学学院 73 精选课件 NMR的非破坏性使得NMR谱图可以确定完整生物大分子中某成分的存在和浓度从而与X Ray晶体衍射互为补充 74 精选课件 核磁共振成像 基本原理 是将人体置于特殊的磁场中 用无线电射频脉冲激发人体内氢原子核 引起氢原子核共振 并吸收能量 在停止射频脉冲后 氢原子核按特定频率发出射电信号 并将吸收的能量释放出来 被体外的接受器收录 经电子计算机处理获得图像 75 精选课件 核磁共振测深 核磁共振测深是MRI技术在地质勘探领域的延伸 通过对地层中水分布信息的探测 可以确定某一地层下是否有地下水存在 地下水位的高度 含水层的含水量和孔隙率等地层结构信息 76 精选课件 优缺点 优点 可以在水溶液或有机相中研究生物大分子结构 研究溶液条件的改变对生物大分子三维结构的影响以及生物大分子内部动力学的特点 缺点 分辨率不高 目前 NMR只能用于测定小分子和中型蛋白质的结构 from 厦门大学生命科学学院 77 精选课件 NMR法测定蛋白质结构的基本实验步骤 1 样品制备 一般应采用液态样品 CCl4溶解2 一维NMR实验3 二维NMR实验4 三维NMR实验5 有的还要做四维NMR实验 78 精选课件 79 精选课件 X 射线晶体衍射法 核磁共振波谱的关系NMR法一般只能解析相对较小的蛋白质 X 射线晶体衍射法适用于研究各种大小的蛋白质 有些蛋白质水溶性很差 却很容易培养成晶体 另一些蛋白质则水溶性很好 培养成晶体很困难 80 精选课件 第三节蛋白质结构测定的其他方法 X射线晶体衍射技术和核磁共振技术是当前蛋白质空间结构测定的主要方法 但它们都存在一些不足 X射线晶体衍射技术要求蛋白质是晶体存在状态 而对一些柔性的 结构复杂的生物大分子蛋白质来说 比较难以得到所需的晶体结构 核磁共振技术能测出溶液状态下分子量较小蛋白质的结构 但对分子量较大的蛋白质的数据处理显得比较复杂 81 精选课件 因此 下面介绍一些其他测定蛋白质结构的方法 现代光谱技术三维电镜衍射技术动力学全精研究技术 82 精选课件 一 现代光谱技术 除传统的紫外 可见差光谱法和荧光光谱法外 圆二色谱 激光拉曼光谱以及质谱也在测定蛋白质溶液构象方面发挥着重要的作用 83 精选课件 圆二色谱 CircularDichroism CD 圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种简单 快速而又较准确的方法 圆二色谱是利用不对称分子对左 右圆偏振光吸光率的不同来分析蛋白质的结构 1969年 Greenfield用圆二色光谱数据估计了蛋白质的二级结构 此后 关于利用圆二色谱研究蛋白质空间结构的报道逐渐增多 84 精选课件 平面偏振光 圆偏振光和椭圆偏振光 平面偏振光 指振动方向在同一平面内的电磁波 圆偏振光 当两束振幅相等 互相垂直的偏振光位相相差1 4波长 90 时 其合成矢量绕光传播方向旋转前进 朝着光源方向观察时 电场矢量E末端轨迹为圆形 所以称之为圆偏振光 电场矢量方向顺时针方向旋转的称为右圆偏振光 逆时针方向旋转的则称左圆偏振光 椭圆偏振光 振幅不等的左 右圆偏振光合成 85 精选课件 圆二色性和圆二色谱 圆二色性 当左 右圆偏振光进入物质时 光学活性物质分子对它们的吸收不一样 它们的差值就是圆二色性光学活性物质分子对左 右圆偏振光的吸收不一样 这种吸收差造成矢量振幅差 从介质出来的光成为椭圆偏振光 用椭圆度或吸收差表示圆二色谱 指椭圆度 或比椭圆度等 与波长的关系 它在本质上与旋光色散谱是一样的 86 精选课件 圆二色谱的应用 在分子生物学中 圆二色仪主要应用于测定生物大分子的空间结构 生物大分子很多是不对称的 即光学活性分子 通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在溶液状态下的二级结构 87 精选课件 蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子 主要的光学活性生色基团是肽链骨架中的肽键 芳香氨基酸残基及二硫键 另外 有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性有影响 肽键的不对称性使得它总有光活性 88 精选课件 蛋白质的圆二色性主要由活性生色基团及折叠结构两方面圆二色性的总和 根据电子跃迁能级能量的大小 蛋白质的CD光谱分为三个波长范围 1 250nm以下的远紫外光谱区 圆二色性主要由肽键的n 电子跃迁引起 远紫外CD主要应用于蛋白质二级结构的解析2 250 300nm的近紫外光谱区 主要由侧链芳香基团的 电子跃迁引起 近紫外CD主要揭示蛋白质的三级结构信息3 300 700nm的紫外 可见光光谱区 主要由蛋白质辅基等外在生色基团引起 紫外 可见光CD主要用于辅基的偶合分析 89 精选课件 肽键是高度有规律排列的 其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况 具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生CD谱带的位置 吸收的强弱都不相同 因此 根据所测得蛋白质或多肽的远紫外CD谱 能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息 从而揭示蛋白质或多肽的二级结构 90 精选课件 螺旋结构在靠近192nm有一正的谱带 在222和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带 折叠的CD光谱在216nm有一负谱带 在185 200nm有一正谱带 转角在206nm附近有一正CD谱带 而左手螺旋P2结构在相应的位置有负的CD谱带 如上图和表所示 91 精选课件 92 精选课件 CD数据拟合计算蛋白质的二级结构的方法基本原理是假设蛋白质在波长 处的CD信号 是蛋白质中或多肽各种二级结构组分及由芳香基团引起的噪音的线性加 fi i noise i是第i个二级结构成分的CD信号值 fi为第i个二级结构成分的含量分数 fi规定值为1 通过已知蛋白 或称参考蛋白 二级结构的圆二色数据库 曲线拟合未知蛋白或多肽的圆二色数据 估算未知蛋白或多肽的二级结构 93 精选课件 蛋白质或多肽的二级结构拟合计算方法中 主要采用多聚氨基酸为参考多肽 Greenfield等采用多聚L lys作参考多肽 建立 螺旋 折叠及无规卷曲等二级结构参考CD光谱曲线 采用单一波长法 208nm 计算出 螺旋含量后 然后假设不同的 折叠含量 X 值 并假设CD值是 螺旋含量 XH 折叠含量 X 无规卷曲 XR 三者贡献值的加和 即 XH X XR 1 94 精选课件 通过计算得到不同波长的 得出计算曲线 假设一些不同的X 值 分别求出它们相应的计算曲线 找出与实验曲线最接近的曲线 相应于该最接近曲线的X 及XR即认为是该蛋白质的相应结构含量 95 精选课件 Examplefit myoglobin 肌红蛋白 Inthiscase qt xaqa xbqb xcqcfitsbestwithxa 80 xb 0 xc 20 agreeswellwithstructure78 helix 22 coil 96 精选课件 激光拉曼光谱 激光拉曼光谱法是研究生物大分子结构 动力学及功能的重要手段 它在物理 化学 医学及生物学等领域都有着十分重要的应用价值 在蛋白质等结构研究方面 拉曼光谱分析可以提供大量的信息 促进蛋白质等生物大分子研究进展 97 精选课件 1928年 印度物理学家拉曼 Raman 发现了拉曼光谱 同时期的苏联物理学家兰斯伯格 G Landsberg 也独立地发现了这一现象 从那时起 拉曼光谱逐渐发展成为一个分析物质结构的有力工具 然而由于拉曼光谱技术强度很弱 时间较长 测定有色物质和发光样品存在困难等缺陷 给其应用带来了很大困难 故在后来很长一段时间内发展比较缓慢 曾一度有被红外光谱取代的趋势 直到1960年激光出现以后 由于激光具有高亮度 单色性和方向性好以及高偏振度等特点 非常适合作为拉曼光谱的激发光源 因而迅速为科研工作者所利用 98 精选课件 质谱 massspectrometry MS 自美国科学家JohnB Fenn和日本学者田中耕一 Koichi Tanaka 发明了对生物大分子进行确认和结构分析的质谱分析法以来 随着生命科学及生物技术的迅速发展 生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃 最富生命力的前沿研究领域之一 生物质谱的发展使人类基因组计划及其后基因组计划得以提前完成 对其实施也起着重要的推动作用 质谱分析法在研究生物大分子特别是蛋白质方面已发展成为主要的技术手段之一 在蛋白质结构的研究中占据着十分重要的地位 99 精选课件 质谱分析基本原理 质谱分析是将样品转化为运动的气态带电离子 于磁场中按质荷比 m z 大小分离并记录的分析方法 其过程可简单描述为 离子源轰击样品 带电荷的碎片离子 电场加速 zeU 获得动能 mv2 磁场分离 检测器记录其中 z为电荷数 e为电子电荷 U为加速电压 m为碎片质量 v为电子运动速度 100 精选课件 质谱分析 MS 的特点 MS用于生物大分子的研究具有以下优点 高灵敏度易操作性准确性快速性很好的普适性高灵敏度能为亚微克级试样提供信息 可以有效地与色谱联用 适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定 101 精选课件 质谱分析的方法 近年来出现的较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种 电喷雾电离质谱基质辅助激光解吸电离质谱快原子轰击质谱离子喷雾电离质谱大气压电离质谱在这些技术中 以前面三种近年来研究得最多 应用得也最广泛 102 精选课件 蛋白质的质谱分析 质谱分析目前主要测定一级结构 包括分子量 肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置 肽和蛋白的质谱测序具有速度快 用量少 易操作等优点 使它非常适合现代科研工作的要求 蛋白质质谱分析原理为 通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子 然后利用质谱分析仪的电场 磁场将具有特定质量与电荷比值 M Z值 的蛋白质离子分离开来 经过离子检测器收集分离的离子 确定离子的M Z值 分析鉴定未知蛋白质 103 精选课件 蛋白质的质谱分析方法 MS用于多肽和蛋白质测序可分为三种方法 第一种方法称为蛋白图谱 proteinmapping 它是使用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段 然后用质谱检测各产物肽的分子量 将所得肽谱数据输入数据库 搜索与之相对应的已知蛋白 从而获取待测蛋白序列 104 精选课件 第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子 通过分析相邻同组类型峰的质量差 识别相应的氨基酸残基 第三种方法称为梯状测序 laddersequencing 是用化学探针或酶解使蛋白或肽从 端或 端逐一降解下氨基酸残基 形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽 再经质谱检测 由相邻峰的质量差可知相应氨基酸残基 105 精选课件 质谱中主要出现的离子有四种 即分子离子 碎片离子 同位素离子和亚稳离子 分子离子分子在离子源中失去一个电子形成的离子 在质谱图中 分子离子对应的峰称分子离子峰 特点 分子离子含奇数个电子 分子离子峰出现在质谱图的最右侧 作用 根据分子离子的质荷比可确定分子量及分子式 106 精选课件 碎片离子 分子离子中的某个化学键断裂而形成的离子 有些碎片离子获得能量