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食品企业实验室的建立与运行 郑凌霄 1 一 实验室的选址 食品企业实验室至少应包括微生物实验室 疫病实验室 化学实验室三种 依据实验室所处理感染性食品致病性微生物危险程序 可把食品微生物实验室分为与致病性微生物的生物危险程度相对应的四个级别 其中一级对生物安全隔离的要求最低 四级最高 2 一 实验室的选址2 食品微生物实验室的选址应考虑和周围环境的关系 一级和二级生物安全食品微生物实验室无需特殊选址 可共用普通建筑物 但必须为实验室安全运行 清洁和维护提供足够的空间 宜设在建筑物的一端或一侧 与建筑物其他部分可相通 但应有控制进出的门和防止昆虫和啮齿动物入内的设置 三级生物安全食品微生物实验室可共用普通建筑物 但应自成一区 宜设在建筑物的一端或一侧 与建筑物其他部分以密封门分开 新建的三级生物安全食品微生物实验室宜远离公共场所和居住建筑 四级生物安全微生物实验室应建造在独立的建筑物内 也可以和其他较低级别的食品微生物实验室共用建筑物 微生物实验室应与疫病实验室完全隔离 所有实验室应与肉类加工厂隔离 3 二 实验室的布局 充足的实验室面积和良好的实验室布局设计是为检验提供安全 规范 适宜 方便的设施和环境条件的失重要前提 实验室总体布局和各区域的安排应符合实验流程 尽量减少往返或迂回 降低潜在的对样本污染和对人员与环境的危害 采取措施将实验区域和非实验区域隔离开来 有些特殊设备可能需要特殊的环境条件 如生物安全柜的位置应远离门 能打开的窗 行走区和其他能引起风压混乱的设备 色谱仪 质谱仪 PCR仪等需恒温恒湿环境 4 二 实验室的布局2 微生物实验室可分为储存室 培养基制备间 无菌室 培养室 仪器室 微生物鉴定室 洗刷室 消毒灭菌室 样品室 办公室等 各房间之间相互隔离 疫病实验室除以上以外还需有动物房 疫病实验室需与微生物实验室隔离 化学实验室需根据检测项目不同或所用主要设备不同进行分间 除此以外还要有清洗间 样品室 建议使用不同的高压灭菌器分别进行培养基灭菌和废弃物灭菌 两个高压灭菌器应分别置于不同的房间 洗常涤区应适当远离实验操作区 5 二 实验室的布局3 实验室的墙壁 天花板应光滑 耐腐蚀 防水 防霉 所有缝隙应可靠密封 防震 防火 地面应防渗漏 无接缝 光洁 防滑 可在墙面上搁架封装成橱柜 用于存放培养基 化学药品和试剂等 并保持干燥 避光 防虫 要提供防火或其他紧急事件的安全出口 在黑暗中可明确辨认的标识 所有出入口应采用防止肢动物和啮齿动物进入的设计 6 三 实验室的用电 用水和通风 实验室要有充足的供电和供水设施 每个房间内要有三相交流电和单项交流电 最好有一个总电源开关 每个实验台上都要有一定数量的电源插座 这些插座应有开关控制和保险设备 实验室内要有充足的照明 避免不必要的反光和闪光 实验室必须保证充足的供水 以满足实验用水和消防用水 实验室的排水要通畅 对于酸性或碱性水应中和后再排放 有毒有害的机溶剂应由专门机构回收处理 不可直接排放 微生物性污水应灭菌消毒后再排放 7 三 实验室的用电 用水和通风2 处理危害程度 级和 级的微生物时 实验室可以使用自然通风 不需特殊的通风设备 但应有空气向内单向流动的机械通风系统 实验室最好安装独立的中央空调 实验室内要有通风橱或排气橱 设计和安装通风系统的原则是对实验室以外区域形成一个相对密闭的系统 对实验室内部则是一个气流定向流动的系统 实验室内部气流定向流动是指实验室内的气流由清洁区流向污染区 每个区域之间要保持一定的压差 一般为 60Pa 10Pa 负压最低区是污染最严重的区域 在通向污染区的出口处要设有气锁 缓冲间内要安装紫外线灯或臭氧对污染空气进行消毒 8 四 洁净室 洁净室的平面布局应按照清污分流的原则 人 物分开 避免交叉污染 人流通道为一缓 二缓 更衣 三缓 风淋 三个缓冲间 物流通道为传递窗口 传递窗口的两道门要有连锁装置 洁净室内所有夹角都设计成圆弧形 净化要用层流净化系统 保证室内的温度 湿度 新风补充和洁净度要求 洁净室和外部应有适当的通讯系统 9 五 实验室橱柜 实验台 通风橱和试剂架等是实验室不可少的橱柜 一般的实验台高度是850mm 边台宽度750mm 中央台宽度1500mm 实验台本身应使用易清洁 耐腐蚀 密实无孔的材料制作 不应有裂缝 实验台应坚固 表面防水 耐热 耐有机溶剂 耐酸碱和耐用于工作台面及设施消毒的其他化学物质 有些实验室设备 如水浴箱 振荡器等 严禁与显微镜和分析天平等精密设备放在同一工作台上 天平应设计有防震装置 10 五 实验室橱柜2 通风柜的台面和内部挡板以及风机和风管均应是由耐腐蚀材料制成 每个通风柜都应有自已独立的供气 供水 压缩空气和供电系统 试剂架应设计有平开门或推拉门 搁板边缘设有突缘 防止试剂不慎跌落 设置在实验台上的试剂架不宜过宽 通常为300mm左右 11 六 实验室的环境监测 对环境微生物的监测包括对实验室表面和空气中微生物的分析 对实验室的表面进行检测 就可以确定在同一工作区内 经过一段时间以后是否还保持干净 或不同工作区在一定时间内需要打扫的次数 消毒剂作用于工作台上的效果如何 间隔多长时间需要对工作台消毒一次 以及层流净化台的使用效果情况且 对空气进行监测 可以确定高效过滤器的使用效果以及需要更换的次数 12 六 实验室的环境监测2 对实验台和工作表面作微生物检查可以采用三种方法 第一种方法叫涂抹法 棉试子法 用于检测设备的任一部分 应在多个区域进行涂抹取样 需氧嗜温菌 5cfu cm2 说明合格 需氧嗜温菌5cfu cm2 25cfu cm2 说明需进一步调查 需氧嗜温菌 25cfu cm2 说明不合格 需立即处理 第二种方法是淋洗法 适用于较小的设备或器具 第三种方法叫影印法 适用于平滑表面进行打扫 清洁并消毒以后使用 13 六 实验室的环境监测3 空气中的微生物要至少每两周进行一次监测 一种简单有效的方法叫沉降法 或称平板沉降技术 即用非选择性培养基平板暴露放置在实验室内各个位置 15分钟后盖上平板盖 放入36 环境下培养48 1h 如果平板菌落 5cfu 板 说明实验室的空气质量不适于进行微生物分析 14 七 无菌区的管理要求 1 操作人员进入无菌室应等关掉紫外灯 2 人员进入无菌间要着无菌衣 帽 口罩和专用鞋 非工作人员不得随意进入 3 无菌室内配备空气净化消毒器或紫外线床进行空气消毒 并定期用适宜的消毒液灭菌清洁 4 无菌室应保持清洁 严禁堆放杂物 以防污染 每日进行湿式小扫除 每周进行大扫除 每月进行空气和实验台表面的细菌学监测 5 需要带入无菌室使用的仪器 器械 平皿等一切物品 均应包扎严密 并应用适宜的方法灭菌 6 操作完毕 应及时潜无菌室 再用紫外线灯辐照灭菌30分钟 15 八 实验室的内务管理 工作区域应有控制出入的门 在出入门口设置明显的禁止或限制无关人员进入的标志 进入工作区域必须穿戴工作服 禁止将与实验无关的物品带入工作区域 工作服应定期清洗 怀疑受到污染的工作服应及时于高压灭菌后清洗 实验室中必须配备个人防护设施 急救设施和灭火器 严禁在工作区域进食 饮水 吸烟 化妆和清洗隐形眼镜 在吸取液体时应使用移液器 吸耳球等 严禁用嘴移液 进行传染性较强的致病菌实验室时 使用一次性外科手术手套 使用后高压灭菌 16 八 实验室的内务管理2 实验室应保持清洁 应备有工作浓度的消毒液 如75 的酒精 5 的来苏儿溶液 0 1 的过氧乙酸等 实验室地面定期用湿式拖扫方法清洁 对工作台和其他表面及时进行消毒和清洁 还必须对通风橱 仪器 设备和玻璃器皿进行清扫 洗涤和消毒 如果不慎将细菌培养物溅在工作台面上或地上 应立即用有效消毒液浸泡在被污染处至少30min 再做清洁 实验完毕后应将实验台面清理干净 并用消毒剂擦拭实验台面 17 八 实验室的内务管理3 实验室废弃物的处理应遵守有关法律法规 实验过程中所有的废弃液不得直接排向污水管道 需集中收集 最后分类处理 理化实验中的废液应集中收集后做PH值测定 如若呈酸性 则以氢氧化钠液中和 如若呈碱性 则用稀盐酸进行中和 直至PH值达到6 8 方可排放 微生物学实验完毕后 需将废弃物以高温高压 121 至少30min 或其他的消毒方式处理后 方可弃掉 理化实验中相应的有机试剂不能自行处理的 应集中收集 委托经政府环境保护部门认定的专业单位处理 实验完毕后 实验用具刷洗时 应根据实验种类 将实验器具进行分类后分别进行刷洗 所有刷洗实验器具的污水不得直接排放 须集中收集后调整PH值 达到6 8时 方可排放至污水管道 18 九 人员及培训 实验室管理人员 全面负责实验室的工作 通常还兼任质量负责人的角色 其职责主要包括负责实验室检测岗位与人员的配置与协调 组织制定与检测有关的规章制度 审查工作质量 负责处理客户提出的申诉 处理重大检测质量问题 制定本实验室的年度工作计划 完成年度的工作总结与质量分析 组织制定实验室的质量方针与质量目标 负责质量体系的管理评审 负责解决工作中遇到的技术难题 负责制定实验室检测人员的技术培训计划并组织实施 组织制定实验室的检测程序及其验证 组织制定与技术体系相关的文件等 实验室管理人员要有良好的品德修养 对所有检测项目有足够的背景知识与经验 熟悉实验室认可与管理 具有良好的实验室管理和综合协调能力 19 实验室检验人员 主要承担实验室检验与新检验技术的研发工作 协助质量负责人解决检测工作中的有关问题 参与实验室方法或程序的制定与验证工作 负责实验室设施与环境条件的控制 参与制定与技术体系相关的文件 收集并跟踪国内外检测方法与标准 实验室检测人员应具备认真负责的工作态度 具有扎实系统的专业知识 熟悉实验室所用检测方法与检测程序 能够对工作中遇到的问题进行分析与解决 20 实验室检测辅助人员 参与检测样品的登记与编号 参与样品的制样 存放与处理 培养基和试剂的配制 废弃物的处理 参与实验室检测消耗品的申购 验收 管理工作 负责实验室及工作环境的清洁工作 按照规定的程序进行检测器皿的清洗及准备工作等 辅助人员应有认真负责的工作态度 熟悉实验室的质量手册和相应的工作程序 21 十 实验室设备 实验室设备主要包括微生物实验 疫病实验 理化实验所必用的设备 主要有 生物安全柜 超净工作台 电热恒温培养箱 电热恒温水箱 电热干燥箱 压力蒸汽灭菌器 pH测试计 温湿度计 电子天平 菌落计数器 涡旋式混合器 拍击式均质器 冰箱 微波炉 显微镜 酶标仪 荧光PCR检测仪 气相色谱仪 高效液相色谱仪 质谱仪 冷冻离心机 微量离心机 微量振荡器 均质器 氮吹仪 旋转蒸发器 超声波清洗器 真空泵 固相萃取装置 自动双重纯水蒸馏器 高温炉 分光光度计 光栅分光光度计 粗蛋白蒸馏器 粗蛋白消化器 分析天平 滴定管等 22 十 实验室设备2 在设备配置上应正确配备检测用的所有设备 既要结合实验工作情况 优化资源配置 做到物尽其用 又要做好设备配置的长远规化 促进技术水平和服务能力的同步发展 同步提高 23 设备质量管理体系 应建立设备质量管理体系 对设备实行全面质量管理 设定设备管理员 制定设备管理程序 编写设备作业指导书 对设备要建立质量管理制度 包括评审制度 验收制度 使用制度 记录制度 核查制度 对实验室所用主要仪器设备要建立档案 对测试结果有直接影响的仪器设备实验室必须建立设备的计量 校准 和使用用中的检查验证程序 24 设备的计量 校准 计划和记录 建立仪器设备的计量 校准 计划和记录 需要强制性定期计量 校准 的仪器和设备 以符合资历的计量部门校准合格后方可使用 并加贴绿 合格 黄 准用 红 停用 三色标志 以表明仪器设备的校准状态 在使用期间 设备主管人及使用人员还应按设备本身的检查或验证规程对仪器设备的使用状态进行检查或验证 如 仪器设备导出数据异常 仪器设备故障维修或改装后 仪器设备经过运输或搬迁 长期脱离实验室控制的仪器设备在恢复使用前 使用实验室控制范围以外的仪器设备等情况下 25 设备的标准操作程序 所有仪器设备要建立标准操作程序 以保证使用人员可以正确使用 所有仪器设备的使用人员应经过专门的技术培训 获得相应的技术资格后经授权批准方可上机操作 使用人员在使用过程中发现设备出现异常情况时 应立即检查并报告设备主管人 使用人员违反仪器设备操作规程操作 有可能对测试结果造成影响的 应采取措施及时处理 设备主管人根据设备维护规程 以设备进行维护和保养 仪器设备出现故障或异常 应立即停止使用 并由相关技术人员进行维修 维修后应经校准或验证 确认正常后方可投入使用 26 十一 实验室器具和材料 在实验室中 要使用许多小型的器具和材料 主要包括 移液管 培养皿 称量纸 脱脂棉 均质袋 封口膜 灭菌指示带 试管 三角瓶 量筒 载玻片 盖玻片 药品匙 镊子 手术剪 移液器 接种针 接种环 蒸馏水 试剂盒等 27 十一 实验室器具和材料2 新的试剂和材料在使用前 应由试剂管理员根据标准方法进行相应的验证并记录 玻璃器具要进行正确的清洗和消毒 对测试结果有直接影响的器具和材料实验室必须计量 校准 计划和记录 需要强制性定期计量 校准 的要以符合资历的计量部门校准合格后方可使用 28 十二 培养基 培养基是指以液体 半固体 或固体形式 包含天然或合成成分 用于促进微生物的繁殖或保持其活力的物质组成 培养基按化学成分分为 纯化学培养基和非纯化学培养基 按状态分为 液体培养基 固体培养基和半固体培养基 按用途分为 增菌培养基 分离培养基 鉴别培养基 鉴定培养基 多用途培养基 29 十二 培养基2 增菌培养基 大多为液体培养基 能够给微生物的繁殖提供较适当的生长环境 包括 1 选择性增菌培养基 能够保证特定的微生物在其中繁殖 而部分或全部抑制其他细菌生长的培养基 如SC LST RV等 2 非选择性增菌培养基 能够保证大多数微生物生长的培养基 如M肉汤 营养肉汤等 30 十二 培养基3 分离培养基 支持微生物生长的固体或半固体培养基 包括 1 选择性分离培养基 支持特定微生物的生长而抑制其他微生物生长的培养基 如PALCAM琼脂 Marconkey琼脂 TCBS 显色培养基等 2 非选择性分离培养基 对微生物没有选择性抑制的分离培养基 如营养琼脂 脑心浸液琼脂等 31 十二 培养基4 鉴别培养基 能够进行一项或多项微生物生理学和生化特性鉴定试验的培养基 如尿素酶培养基等 能够用于分离培养的鉴别培养基被称为分离鉴别培养基 如 XLD DHL TCBS等 鉴定培养基 能够产生一个特定的鉴定反应而不需要做进一步确认实验的培养基 如ONPG 氧化酶试剂 用于分离的鉴定培养基被称为分离鉴定培养基 如显色培养基 多用途培养基 同时具有多种不同用途的特定培养基 例如 血琼脂是一种复苏培养基 又是分离培养基 还可作为溶血试验的鉴别培养基 32 十二 培养基5 培养基应按供应商提供的储存条件 有效期和使用方法进行培养基的保存和使用 正确制备培养基是微生物检验的一个基本步骤 应严格按照厂商提供的使用说明配制 如质量 体积 PH 制备条件 灭菌条件 操作步骤等 在处理脱水培养基和其他含有有害物质的培养基时 应遵守作业指导书和生产厂商的注意事项 33 十二 培养基6 琼脂培养基的融化 将培养基放到沸水浴中或使用有相同效果的方法使之融化 经过高压的培养尽量减少加热时间以保证培养基的质量 避免过度加热 培养基融化后即可将其从加热器上取下 放入47 2 的恒温水浴锅中冷却 直至使用 融化后的培养基应尽快使用 放置时间一般不应超过4h 34 十二 培养基7 培养基的脱气 必要时 将培养基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加热15min 加热时松开容器的盖子 加热后盖紧盖子 迅速冷却至使用的温度 添加成分的加入 对热不稳定的添加成分应在培养基冷却到47 2 时再加入 在加入灭菌的添加成分之前 先放置到室温 避免冷的液体造成琼脂凝结或形成片状物 将加入培养基的所有添加物缓慢充分混匀 然后尽快分装到要使用的容器中 35 十二 培养基8 平板培养基的制备和储存 倾注融化的培养基到平皿中 使之在平皿中开成一个至少2mm厚的琼脂层 直径为90mm的平皿 通常需要加入15mL琼脂培养基 将平皿盖好盖子后放到一个凉的水平平面使琼脂冷却凝固 在培养过程中 培养基会损失水分 当水分损失的量大于培养基总量的15 时 就会影响微生物的生长 36 十二 培养基9 凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和放在4 12 冰箱的密封袋中 最多存放一周或按厂商提供的标准执行 在平板上做好标记 标明名称 配备日期 有效期 将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限 为了避免产生冷凝水 平板应冷却后再装入袋中 储存前不要对琼脂培养基表面进行干燥处理 对于采用表面接种形式培养的固体培养基 应先对琼脂表面进行干燥 干燥时将平板盖揭开 将平板倒扣于烘箱 培养箱 中 温度放为20 50 或放在有对流风的无菌净化台中 直到培养基表面的水滴消失为止 37 十二 培养基10 培养 培养时每垛最多堆放6个平板 平板间要留有空隙以进行空气流通 对于液体培养基 培养基温度与培养箱达到一致取决于很多因素 如体积 内容物量 容器类型 培养类型等 培养基的弃置 所有污染的和未使用的培养基的弃置应采用安全的方式 如高温高压灭菌 且要符合国家和地方法规的规定 38 十三 试剂 实验室用水 食品检验用水为蒸馏水或相应纯度去离子水 某些超纯分析及痕量分析需要使用纯度更高的水 我国GB6682 1992规定 分析实验室用水分三个级别 不包括医药用水 一级水用于有严格要求的分析试验 如高效液相色谱分析用水 二级水用于无机痕量分析等试验 如原子吸收光谱分析用水 三级水用于一般化学分析试验 各级用水均应使用密闭的专用聚乙烯容器 三级水也可用密闭的专用玻璃容器 新容器在使用前需用质量分数为20 的盐酸浸泡2 3天 再用待测水反复冲洗 并注满待测水浸泡6h以上 39 化学试剂分类 一简般试剂 分类为三个等级 即优级纯 分析纯 化学纯 基准试剂 也称为标准试剂 可用来直接配制标准溶液 用来校正或标定其他化学试剂 专用试剂 具有专门用途的试剂 如仪器分析专用试剂中色谱分析标准试剂 气相色谱载体及固定液 薄层分析试剂等 40 化学试剂的储存 大部分化学试剂都具有一定的毒性 有的是易燃易爆危险品 因此必须了解一般化学药品的性质及保管方法 较大量的化学药品应放在样品储藏室中 由专人保管 危险品应按照国家安全部门的管理规定储存 41 溶液的制备 配制标准溶液用水 至少应符合GB T6682 1992中三级水的规格 所用试剂纯度应在分析纯以上 标定所用的基准试剂应为容量分析工作中使用的基准试剂 所用分析天平及砝码应定期检定 所用滴定管 容量瓶及移液管均需定期校正 制备标准溶液的浓度系指20 时的浓度 在标定和使用时 如温度有差异 应按GB T601 2002中附录A进行补正 42 溶液的制备2 标定标准溶液时 平行试验不得少于8次 两人各作4次平行测定 检测结果在按GB T601 2002规定的方法进行数据的取舍后取平均值 浓度值取4位有效数字 配制浓度等于或低于0 02mol L的标准溶液时 应于临用前将浓度高的标准溶液用煮沸并冷却的纯水稀释 必要时重新标定 滴定分析用标准溶液在常温 15 25 下 保存时间一般不得超过两个月 43 溶液配制注意事项 1 分析实验所用的溶液应用纯水配制 容器应用纯水洗三次以上 特殊要求的溶液应事先作纯水的空白值检验 2 溶液要用带塞的试剂瓶盛装 见光易分解的溶液要装于棕色瓶中 挥发性试剂 见空气易变质及放出腐蚀性气体的溶液 瓶塞要严密 浓碱应用塑料瓶装 如装在玻璃瓶中 要用橡皮塞塞紧 不能用玻璃磨口塞 3 每瓶试剂溶液必须有标明名称 浓度和配制日期的标签 标准溶液的标签还应标明标定日期 标定者 44 溶液配制注意事项2 4 配制硫酸 磷酸 硝酸 盐酸等溶液时 都应把酸倒入水中 对于溶解时放热太多的试剂 不可在试剂瓶中配制 以免炸裂 5 用有机溶剂配制溶液时 有时有机物溶解较慢 应不时搅拌 可以在热水浴中温热溶液 不可直接加热 易燃溶剂要远离明火使用 有毒有机溶剂在通风柜内操作 配制溶液的烧杯应加盖 以防有机溶剂的蒸发 6 不能直接用手接触腐蚀性及有剧毒的溶液 剧毒溶液应作解毒处理 不可直接倒入下水道 45 十四 微生物检测技术 1 平板计数法 稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落 即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法 即一个菌落代表一个单细胞 计数时 首先将待测样品制成均匀的系列稀释液 尽量使样品中的微生物细胞分散开 使成单个细胞存在 否则一个菌落就不只是代表一个细胞 再取一定稀释度 一定量的稀释液接种到平板中 使其均匀分布于平板中的培养基内 经培养后 由单个细胞生长繁殖形成菌落 统计菌落数目 即可计算出样品中的含菌数 此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数 故又称活菌计数 一般用于某些成品检测 生物制品检验 土壤含菌量测定及食品 水源的污染程度的检验 46 十四 微生物检测技术2 2 稀释培养计数法 MPN 最大或然数 mostprobablenumber MPN 计数又称稀释培养计数 适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势 但却具有特殊生理功能的类群 本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群的数量和检测污水 牛奶及其他食品中特殊微生物类群 如大肠菌群 的数量 缺点是只适于进行特殊生理类群的测定 结果也较粗放 只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用 47 十四 微生物检测技术3 MPN计数是将待测样品作一系列稀释 一直稀释到将少量 如lmL 的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖 根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度 采用 最大或然数 理论 可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值 具体地说 菌液经多次10倍稀释后 一定量菌液中细菌可以极少或无菌 然后每个稀释度取3 5次重复接种于适宜的液体培养基中 培养后 将有菌液生长的最后3个稀释度 即临界级数 中出现细菌生长的管数作为数量指标 由最大或然数表上查出近似值 再乘以数量指标第一位数的稀释倍数 即为原菌液中的含菌数 48 十四 微生物检测技术4 如某一细菌在稀释法中的生长情况如下 稀释度lO 310 410 5lO 610 710 8重复数555555出现生长的管数555410 49 十四 微生物检测技术5 根据以上结果 在接种lO 3 10 5稀释液的试管中5个重复都有生长 在接种lO 6稀释液的试管中有4个重复生长 在接种10 7稀释液的试管中只有1个生长 而接种10 8稀释液的试管全无生长 由此可得出其数量指标为 541 查最大或然数表得近似值17 然后乘以第一位数的稀释倍数 10 5的稀释倍数为100000 那么 1ml原菌液中的活菌数 17 100000 17 105 即每毫升原菌液含活菌数为l700000个 50 十四 微生物检测技术6 在确定数量指标时 不管重复次数如何 都是3位数字 第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管 后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数 按照重复次数的不同 最大或然数表又分为三管最大或然数表 四管最大或然数表和五管最大或然数表 51 十四 微生物检测技术7 应用MPN计数 应注意两点 一是菌液稀释度的选择要合适 其原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长 而最高稀释度的所有重复无菌生长 二是每个接种稀释度必须有重复 重复次数可根据需要和条件而定 一般2 5个重复 个别也有采用2个重复的 但重复次数越多 误差就会越小 相对地说结果就会越正确 不同的重复次数应按其相应的最大或然数表计算结果 我国的国标是采用3个重复 52 十四 微生物检测技术8 3 接种技术 在实验室或工厂实践中 用得最多的接种工具是接种环 接种针 由于接种要求或方法的不同 接种针的针尖部常做成不同的形状 有L形 耙形等之分 有时滴管 吸管也可作为接种工具进行液体接种 在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时 需要用到涂布棒 53 十四 微生物检测技术9 接种和分离工具1 接种针2 接种环3 接种钩4 5 玻璃涂棒6 接种圈7 接种锄8 小解剖刀 54 常用的接种方法有以下几种 划线接种这是最常用的接种方法 即在固体培养基表面作来回直线形的移动 就可达到接种的作用 常用的接种工具有接种环 接种针等 在斜面接种和平板划线中就常用此法 55 穿刺接种 2 穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法 做穿刺接种时 用的接种工具是接种针 用的培养基一般是半固体培养基 它的做法是 用接种针蘸取少量的菌种 沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺 如某细菌具有鞭毛而能运动 则在穿刺线周围能够生长 56 倾注接种 3 倾注接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中 然后再倒入冷却至45 C左右的固体培养基 迅速轻轻摇匀 这样菌液就达到稀释的目的 待平板凝固之后 置合适温度下培养 就可长出单个的微生物菌落 57 涂布接种和液体接种 4 涂布接种与浇混接种略有不同 就是先倒好平板 让其凝固 然后再将菌液倒入平板上面 迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布 让菌液均匀分布 就可长出单个的微生物的菌落 5 液体接种从固体培养基中将菌洗下 倒入液体培养基中 或者从液体培养物中 用移液管将菌液接至液体培养基中 或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中 都可称为液体接种 58 其它接种 6 注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内 如人或其它动物中 常见的疫苗预防接种 就是用注射接种 接入人体 来预防某些疾病 7 活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法 因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖 所用的活体可以是整个动物 也可以是某个离体活组织 例如猴肾等 也可以是发育的鸡胚 接种的方式是注射 也可以是拌料喂养 59 4 无菌接种操作 培养基经高压灭菌后 用经过灭菌的工具 如接种针和吸管等 在无菌条件下接种含菌材料 如样品 菌苔或菌悬液等 于培养基上 这个过程叫做无菌接种操作 在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作 60 4 无菌接种操作2 实验台面不论是什么材料 一律要求光滑 水平 光滑是便于用消毒剂擦洗 水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致 在实验台上方 空气流动应缓慢 杂菌应尽量减少 其周围杂菌也应越少越好 为此 必须清扫室内 关闭实验室的门窗 并用消毒剂进行空气消毒处理 尽可能地减少杂菌的数量 61 4 无菌接种操作3 空气中的杂菌在气流小的情况下 随着灰尘落下 所以接种时 打开培养皿的时间应尽量短 用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌 接种环的火焰灭菌方法 通常接种环在火焰上充分烧红 接种柄 一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次 冷却 先接触一下培养基 待接种环冷却到室温后 方可用它来挑取含菌材料或菌体 迅速地接种到新的培养基上 下图 然后 将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌 复原 不要直接烧环 以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间 平板接种时 通常把平板的面倾斜 把培养皿的盖打开一小部分进行接种 在向培养皿内倒培养基或接种时 试管口或瓶壁外面不要接触底皿边 试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过 62 斜面接种时的无菌操作 1 接种灭菌 2 开启棉塞 3 管口灭菌 4 挑起菌苔 5 接种 6 塞好棉塞 63 5 分离纯化 含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物 Mixedculture 如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞 那么这个菌落称为纯培养 Pureculture 在进行菌种鉴定时 所用的微生物一般均要求为纯的培养物 得到纯培养的过程称为分离纯化 方法有许多种 64 倾注平板法 首先把微生物悬液通过一系列稀释 取一定量的稀释液与熔化好的保持在40 50 左右的营养琼脂培养基充分混合 然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中 待凝固之后 把这平板倒置在恒箱中培养 单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落 取单个菌落制成悬液 重复上述步骤数次 便可得到纯培养物 65 涂布平板法 首先把微生物悬液通过适当的稀释 取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上 然后用无菌的玻璃弯棒把稀释液均匀地涂布在培养基表面上 经恒温培养便可以得到单个菌落 66 分离纯化图解 倾注平板法 a 涂布平板法 b 图解1 菌悬液2 熔化的培养基3 培养物4 无菌水 67 平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法 用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线 划线的方法很多 常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法 曲线法 方格法 放射法 四格法等 当接种环在培养基表面上往后移动时 接种环上的菌液逐渐稀释 最后在所划的线上分散着单个细胞 经培养 每一个细胞长成一个菌落 68 平板划线分离法 1 斜线法2 曲线法3 方格法4 放射法5 四格法 69 平板划线的操作 70 富集培养法 富集培养法的方法和原理非常简单 我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长 在这些条件下 所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争 在生长能力方面远远超过其他微生物 所创造的条件包括选择最适的碳源 能源 温度 光 pH 渗透压和氢受体等 在相同的培养基和培养条件下 经过多次重复移种 最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落 如果要分离一些专性寄生菌 就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中 使其大量生长 通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌 71 厌氧法 在实验室中 为了分离某些厌氧菌 可以利用装有原培养基的试管作为培养容器 把这支试管放在沸水浴中加热数分钟 以便逐出培养基中的溶解氧 然后快速冷却 并进行接种 接种后 加入无菌的石蜡于培养基表面 使培养基与空气隔绝 另一种方法是 在接种后 利用N2或CO2取代培养基中的气体 然后在火焰上把试管口密封 有时为了更有效地分离某些厌氧菌 可以把所分离的样品接种于培养基上 然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中或用不透气的密封膜密封 72 6 细菌培养 微生物的生长 除了受本身的遗传特性决定外 还受到许多外界因素的影响 如营养物浓度 温度 水分 氧气 等 微生物的种类不同 培养的方式和条件也不尽相同 73 影响微生物生长的因素 营养物浓度细菌的生长率与营养物的浓度有关 营养物浓度与生长率的关系曲线是典型的双曲线 细菌所需要的营养浓度非常之低 所以在自然界中 它们到处生长 然而营养太低时 细菌生长就会遇到困难 甚至还会死亡 这是因为除了生长需要能量以外 细菌还需要能量来维持它的生存 这种能量称为维持能 另一方面 随着营养物浓度的增加 生长率愈接近最大值 74 温度 在一定的温度范围内 每种微生物都有自已的生长温度三基点 最低生长温度 最适生长温度和最高生长温度 在生长温度三基点内 微生物都能生长 但生长速率不一样 微生物只有处于最适生长温度时 生长速度才最快 代时最短 超过最低生长温度 微生物不会生长 温度太低 甚至会死亡 超过最高生长温度 微生物也要停止生长 温度过高 也会死亡 一般情况下 每种微生物的生长温度三基点是恒定的 但也常受其它环境条件的影响而发生变化 75 温度2 根据微生物最适生长温度的不同 可将它们分为三个类型 a 嗜冷微生物 其是适生长温度多数在 10 20 之间b 中温微生物 其最适生长温度一般在20 45 之间c 嗜热微生物 生长温度在45 以上 76 水分 水分是微生物进行生长的必要条件 芽孢 孢子萌发 首先需要水分 微生物是不能脱离水而生存的 但是微生物只能在水溶液中生长 而不能生活在纯水中 各种微生物在不能生长发育的水分活性范围内 均具有狭小的适当的水分活性区域 77 氧气 按照微生物对氧气的需要情况 可将它们分为以下五个类型 a 需氧微生物这类微生物需要氧气供呼吸之用 没有氧气 便不能生长 但是高浓度的氧气对需氧微生物也是有毒的 很多需氧微生物不能在氧气浓度大于大气中氧气浓度的条件下生长 绝大多数微生物都属于这个类型 78 氧气2 b 兼性需氧微生物这类微生物在有氧气存在或无氧气存在情况下 都能生长 只不过所进行的代谢途径不同罢了 在无氧气存在的条件下 它进行发酵作用 例如酵母菌的无氧乙醇发酵 c 微量需氧微生物这类菌是需要氧气的 但只在0 2大气压下生长最好 这可能是由一它们含有在强氧化条件下失活的酶 因而只有在低压下作用 79 氧气3 d 耐氧微生物这类微生物在生长过程中 不需要氧气 但也不怕氧气存在 不会被氧气所杀死 e 厌氧微生物这类微生物在生长过程中 不需要分子氧 分子氧存在对它们生长产生毒害 不是被抑制 就是被杀死 80 培养方法 根据培养时是否需要氧气 可分为好氧培养和厌氧培养两大类 好氧培养 也称 好气培养 就是说这种微生物在培养时 需要有氧气加入 否则就不能生长良好 在实验室中 斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气 三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡 使外界的空气源源不断地进入瓶中 厌氧培养 也称 厌气培养 这类微生物在培养时 不需要氧气参加 在厌氧微生物的培养过程中 最重要的一点就是要除去培养基中的氧气 81 培养方法2 根据培养基的物理状态 可分为固体培养和液体培养两大类 固体培养 是将菌种接至疏松而富有营养的固体培养基中 在合适的条件下进行微生物培养的方法 液体培养 在实验中 通过液体培养可以使微生物迅速繁殖 获得大量的培养物 在一定条件下 还是微生物选择增菌的有效方法 82 十五 常见微生物 1 食品的细菌污染指标 是评价食品卫生质量的重要手段 其主要指标有菌落总数 大肠菌群和致病菌 83 1 菌落总数 是指在被检样品的单位重量 g 容积 ml 或表面积 cm2 内 在规定的条件下培养生成的细菌菌落总数 菌落总数的食品卫生学意义 直接意义 可作为食品被细菌污染程度 即清洁状态 的标志 间接意义 可推断食品鲜度 耐保藏性和致病性 84 2 大肠菌群 coliformgroup 是一组来自人和温血动物肠道 粪便 在35 37 下能发酵乳糖产酸产气 需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌 包括肠杆菌科的埃希菌属 典型肠杆菌属 柠檬酸杆菌属 肠杆菌属和克雷伯菌属 后三者为非典型肠杆菌属 大肠菌群已被许多国家用作食品质量鉴定的指标 85 大肠菌群的食品卫生学意义 直接意义 可作为食品被人或温血动物粪便污染的指示菌 原因 特异 仅来自肠道 数量多 易检出 环境抵抗力强 检验方法灵敏 间接意义 可推断食品被肠道致病菌污染的可能性 由于大肠菌群与肠道致病菌来源相同 而且在外界生存的时间与主要肠道致病菌 如致病菌沙门氏菌属 志贺菌属 相当 所以大肠菌群可作为肠道致病菌污染食品的指示菌 86 大肠菌群数量的表示和数据的产生 大肠菌群数量的表示 相当于100g或100ml食品的最近似数 MPN 数据的产生 按照一定的方案 即样品三个稀释度各三管的乳糖发酵三步法 并根据各种可能的检验结果 编制相应的MPN检索表 87 2 致病菌 此类细菌随食物进入人体后可引起食源性疾病 常见者如沙门菌 志贺菌等 与菌落总数和大肠菌群的卫生学意义不同 致病菌与疾病直接有关 因此一般规定在食品中不允许检出 菌落总数和大肠菌群属于卫生指示菌 主要用于评价食品的卫生质量和安全性 可允许在食品中存在 但不得超过规定的限量 88 1 沙门氏菌 Salmonella 沙门氏菌是一种严重的食源性致病菌 可感染多种动物 临床表现为败血症和肠炎 涉及的食品有生肉 禽 海产品 蛋 奶制品 酵母 酱油 色拉调料 蛋糕粉 奶油 夹心甜点 糖果等 人通过被污染的食品如牛肉 禽肉 蛋 奶或直接与动物接触而感染 患者出现恶心 呕吐 腹泻 伴有肌肉酸痛 视觉模糊 腹部痉挛 发烧 平均致死率4 1 近来 因沙门氏菌对禽肉的污染而造成的食物中毒事件呈明显上升趋势 沙门氏菌主要感染禽类 人们食用了被沙门氏菌感染的禽肉而发生食源性感染 89 沙门氏菌的预防措施 充分加热产品杀菌 将产品贮存于4 C 40 F 温度下冷藏防止沙门氏菌生长 防止加热杀菌后交叉污染 禁止病人和沙门氏菌携带者进入食品加工间 90 2 大肠杆菌 Escherichiacoli 幼龄畜禽对本菌最易感 如仔猪黄痢和白痢发病率和死亡率都很高 雏鸡的发病率达30 60 病死率几乎达100 部分大肠杆菌菌株与食源性疾病有关 其中肠出血性大肠杆菌O157 H7能产生细胞毒素并引发严重感染 感染O157大肠杆菌的患者 轻者恶心 腹胀腹泻 重者脱水 可发生酸中毒或急性肾功能衰竭而死亡 91 3 大肠菌群 粪大肠菌群 大肠杆菌 大肠菌群 Coliforms 革兰氏阴性无芽孢杆菌 分解乳糖产酸产气的需氧或兼性厌氧的一群细菌 包括许多肠杆菌科细菌 这一名称是卫生细菌学领域的用语 而不是细菌学上的分类 粪大肠菌群 Fecalcoliforms 大肠菌群中能在44 5 C生长 分解乳糖产生气体的细菌 大肠杆菌 Escherichiacoli 粪大肠菌群中靛基质试验 I 甲基红反应 M V P反应 枸橼酸利用试验等4项生化试验为 或 的细菌 92 4 金黄色葡萄球菌 分布 该菌无处不在 广泛分布于水 空气 灰尘 污物 食品加工设备表面 50 60 健康人的鼻腔 口腔 咽喉 皮肤 甚至头发都有发现 中毒症状 恶心 呕吐 腹部痉挛 水性或血性腹泻和发烧 本菌特征 嗜温 最低生长温度为10 C 耐盐 在含水量极少的食品 水分或度为0 86 盐度为18 上可生长 产生外毒素 肠毒素 引起急性肠胃炎 93 4 金黄色葡萄球菌2 肠毒素 对蛋白酶和热具极强的抗性 100 30min仍保持部分毒性 巴氏消毒和一般家庭烹调温度不能破坏这类毒素 涉及的食品 禽 肉 色拉 烘烤品 三明治 乳制品 水产品等 罐头食品应高度重视金黄色葡萄球菌 94 金葡的预防措施 减少食品的暴露时间 特别避免是加热后的半成品积压 控制加工车间的温度 要求食品操作人员保持良好的个人卫生 调离皮肤有创伤的加工人员 95 金葡平板菌落图 96 十六 微生物检验方法 按标准的性质分 可分为标准方法和非标准方法 标准方法是指国际 区域 国家发布的经过严格确认的以及公认的方法 标准方法包括参考方法和公定方法 参考方法是指适用于特殊待验目标的经过国际或国家公认的检验方法 公定方法是指知名的技术组织或机构公布的检测方法 97 十六 微生物检验方法2 目前国内食品类微生物检测方法常用 中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验 GB T4789 和 出口食品微生物检验标准 SN 有些官方机构用国际检测方法 如国际标准化组织 ISO 网址为 http www iso org 98 选择检验方法时 应考虑以下因素 1 客户要求 2 方法的准确性 3 方法的特异性 4 方法的实用性 5 方法的稳定性 6 方法的灵敏性 7 方法的检测限和测量限 8 实验室硬件条件 9 商业快速检测系统的供应保证 价格 认可程度和售后服务 在没有客户要求的情况下 标准检验方法是企业实验室首选的检验方法 但在本身检测能力有限的情况下 可以只用其中的一部分步骤进行初筛 或检测到 属 若有必要进行进一步的确认或确 定到 种 可申请由权威机构进行鉴定 99 十七 消毒与灭菌 消毒 消灭病原菌和有害微生物的营养体 即杀灭